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研究背景GDF9与BMP15属于TGF-β（Transforming growth factor-β）superfamily,是卵母细胞分泌因子,通过内分泌或者旁分泌的方式驱动早期卵泡发育,二者具有高度氨基酸同源性,能够形成异源二聚体称为Cumulin,通过SMAD2/3途径调节卵丘细胞的扩张,调控卵母细胞的发育。卵丘细胞的扩张对于排卵至关重要,由颗粒细胞外基质成分改变引起,该过程受LH非直接作用和卵母细胞分泌因子GDF9、BMP15直接作用调节。既往研究结果显示大部分GDF9突变为杂合突变,导致不同表型包括PCOS、POI、异卵双胞胎以及DOR,目前仅有1例GDF9纯合突变的报道。有文献报道两种杂合突变GDF9 c.118T>G、c.1283G>C为错义突变,造成GDF9蛋白质L40V、S428T突变,导致GDF9前蛋白（Proprotein）、成熟蛋白（Mature protein）受影响,这两种杂合突变均表现为PCOS。在广州医科大学附属第三医院生殖医学中心取卵失败患者全外显子测序数据库中发现一例患者A同时携带GDF9 c.118T>G、c.1283G>C突变,该患者两个IVF周期获卵数均为0,卵泡液中均未见颗粒细胞,临床诊断为DOR、EFS,这与上述报道的PCOS、POI表型等不一致。本研究受这种临床现象启发,拟通过研究GDF9突变引起蛋白质变化,协同BMP15对下游通路的改变,来阐述GDF9突变对卵巢功能的影响。方法1.提取病例A gDNA,设计引物,PCR产物测序验证该病例发生的GDF9突变位点。2.病例A gDNA经过PCR,T-A克隆,测序验证GDF9突变类型。3.对病例A基本临床特征进行整理;用Mutation Taster网站数据库对GDF9突变c.118T>G、c.1283G>C造成的蛋白功能损伤及致病性进行预测。4.构建GDF9基因表达质粒、GDF9-BMP15共表达质粒,体外实验研究GDF9突变对其在HEK-293T细胞内外表达的影响。5.制备含有GDF9（WT/Mutant）-BMP15的条件培养液,培养人卵丘颗粒细胞,观察对其SMAD2信号通路的影响。结果1.病例A存在GDF9 c.118T>G和c.1283G>C复合杂合突变,临床上表现为两个IVF周期获卵数为0、颗粒细胞为0的EFS表型。2.体外实验中,GDF9基因过表达时,与WT组相比S428T组GDF9前蛋白在HEK-293T细胞内含量显著升高,GDF9前蛋白与成熟蛋白细胞外分泌量均显著减少。GDF9-BMP15共表达时,与WT组相比S428T组GDF9前蛋白在HEK-293T细胞内含量显著升高,GDF9前蛋白与成熟蛋白细胞外分泌量均显著减少,与WT组相比S428T组BMP15前蛋白在HEK-293T细胞中相对表达量显著降低,BMP15前蛋白细胞外分泌量显著增多、成熟蛋白分泌量显著减少,其他组与WT组相比无显著差异。3.含有GDF9-S428T-BMP15共表达蛋白的条件培养液对人卵丘颗粒细胞SMAD2磷酸化产生不良影响,使其磷酸化水平降低。结论病例A GDF9基因发生c.118T>G、c.1283G>C复合杂合突变;GDF9 c.1283 G>C突变造成GDF9-S428T蛋白突变,体外实验中该突变显著下调GDF9成熟蛋白表达;共表达时GDF9-S428T突变显著下调GDF9-BMP15成熟蛋白分泌,并能降低体外培养人卵丘颗粒细胞SMAD2磷酸化水平。