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新型生物农药申嗪霉素,其有效成分为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA),对甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治具有广谱、高效、低毒、环境相容性好、生产成本低等显著特点。但在生物防治过程中发现,吩嗪-1-羧酸在大田中易被降解,影响其防治效果,因此需要研究吩嗪-1-羧酸的生物降解机理,了解它的环境行为,为提高申嗪霉素的防治效果、合理使用申嗪霉素奠定基础。
本文主要的研究内容是筛选与分离吩嗪-1-羧酸降解菌。在研究中发现,从黄瓜根际土壤、辣椒根际土壤、西红柿根际土壤、青菜根际土壤、西葫芦根际土壤,共5份土壤样品中,经过富集培养后得到的富集培养液混合菌群都对吩嗪-1-羧酸具有良好的降解效果,一般在7天内都能完全降解一定浓度(200mg/L)的吩嗪-1-羧酸。由此可以初步推断,在自然的土壤环境中,能够降解吩嗪-1-羧酸的细菌是广泛存在的。
接着,本研究以吩嗪-1-羧酸为唯一碳氮源,从“吩嗪-1-羧酸防治辣椒疫霉试验”中的辣椒疫霉发病植株根际土壤中分离到了96株能够利用吩嗪-1-羧酸生长的菌株。通过16S rDNA PCR扩增产物的限制性酶切分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA),将这96株菌株分为16种类型;其中以菌株V-6为代表的ARDRA类型a所占的丰度最高,为21.9%,其次是以菌株101为代表的ARDRA类型d,该类型所占的丰度为16.7%,这两种ARDRA类型可能是环境中吩嗪-1-羧酸的优势降解菌。对16种类型的代表菌株的16S rDNA的部分序列(500bp)进行基因测序,测序结果在GenBank中比对,分析其在系统发育分类学上的地位。其中,菌株V-6,204和207分属于细菌拟杆菌门的不同纲目,菌株132属于放线菌中的红球菌属,其它12株菌株分属于α、β、γ-变形菌纲。16株代表菌株各自单独降解吩嗪-1-羧酸的效率比较低,培养35天后的降解率为16.5%~34.6%。降解效率最高的两株菌株为133和102,其降解率分别为34.6%和32.9%,与菌株133亲缘关系最近的菌为Pseudomonas alcaligenes,同源性为100%;与菌株102亲缘关系最近的菌为Pseudomonas putida KT2440,同源性为99%。将16株代表菌株等量人为组成混合微生物体系后,其降解效率7天即可达到26.8%,28天后达到43.8%,混合菌株的降解效率明显优于单菌。
本文通过DGGE方法监测混合菌群(该混合菌群为辣椒疫霉试验中辣椒疫霉发病植株的根际土壤经过富集培养、接种到PCA液体培养基中生长的混合菌群)在不同时段对吩嗪-1-羧酸的降解过程中微生物菌群结构的变化,发现随着吩嗪-1-羧酸的降解,微生物菌群结构没有明显的变化,没有优势菌群的出现或者消失。用16S rDNA建库测序分析的方法,分析了具有降解吩嗪-1-羧酸能力的混合微生物菌群的结构。结果显示, 16S rDNA文库可分为18个OUT,其中与丰度最高的OUT亲缘关系最近的菌是Pseudomonas sp. BCNU171,同源性为100%。
通过比较分析发现,传统培养的方法获得的16株菌株与不依赖于培养的16S rDNA建库测序分析方法所得的18个OUT的序列结果不一致。分离得到的16种纯菌在16S rDNA克隆文库中没有找到相对应的克隆,意味着在本实验中传统的微生物培养方法与分子生物学方法鉴定得到的微生物信息存在着很大的差异。
本文首次从土壤中分离得到了吩嗪-1-羧酸降解菌,为进一步研究吩嗪-1-羧酸的生物降解途径奠定基础。