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背景:食管癌是我国高发、地域性明显的恶性肿瘤,全球每年新发病例中约50%以上发生在中国,而河南地区是全球食管癌发生率和死亡率最高的地区,与西方国家绝大部分为食管腺癌迥然不同的是我国食管癌的主要病理类型为鳞癌,两者在发病机制上完全不同,是两种不同的疾病[1]。由于食管鳞癌的发病机制尚不清楚,尽管近年来在治疗方面取得了较大进展,但其死亡率仍无明显下降。研究表明肿瘤细胞的迁移侵袭是导致食管癌预后差的主要原因,在导师课题组前期研究中,意外发现SHARPIN缺失可显著降低食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力,而Hippo通路核心效应因子YAP的缺失则可逆转这种现象,提示SHARPIN可能调控Hippo通路核心效应因子YAP发挥抑癌作用。因此,深入阐明SHARPIN调控Hippo通路的具体机制,可为食管癌的精准治疗提供新的思路,具有重要意义。目的:探讨SHARPIN调控食管鳞癌Hippo信号通路发挥抑癌功能的具体分子机制,为研制靶向药物提供新的思路。方法:1.在Eca109食管鳞癌细胞系中,通过转染小干扰RNA（si RNA）从而沉默SHARPIN基因,再分别用Western blot、免疫荧光、q RT-PCR实验从蛋白水平、荧光水平以及m RNA水平检测SHARPIN的沉默效率。2.在Eca109、KYSE150两个食管鳞癌细胞系中,通过转染两种不同的si RNA标记为si SHARPIN#1、si SHARPIN#2得到沉默SHARPIN后的食管鳞癌细胞系,并经Transwell实验和划痕实验评估沉默SHARPIN对食管鳞癌细胞侵袭及迁移能力的影响。3.在Eca109、KYSE150两个食管鳞癌细胞系中转染si RNA或SHARPIN质粒,获得SHARPIN低表达以及高表达食管鳞癌细胞系,提取蛋白和RNA,并通过Western blot和q RT-PCR技术,评估SHARPIN对Hippo信号通路核心效应因子YAP蛋白水平以及其下游主要靶基因m RNA水平的影响。4.在Eca109、KYSE150两个食管鳞癌细胞系中分别构建沉默SHARPIN基础上同时沉默YAP的食管鳞癌细胞系,通过迁移、侵袭表型挽救实验评估YAP的缺失能否逆转单纯沉默SHARPIN后食管鳞癌迁移侵袭能力增强的这一现象,并应用Western blot、q RT-PCR技术进一步评估YAP的缺失能否逆转单纯沉默SHARPIN后YAP蛋白水平以及其下游靶基因m RNA水平升高这一趋势。5.通过免疫荧光实验检测SHARPIN与YAP在Eca109食管鳞癌细胞系中的细胞共定位。在HEK293T细胞系中共转染YAP和SHARPIN质粒,通过免疫共沉淀方法判断SHARPIN和YAP是否相互结合,并通过结构域实验进一步探讨其相互结合的具体结构域。6.应用Western blot技术,通过在HEK293T细胞以及Eca109食管鳞癌细胞系中行CHX和MG132实验判断SHARPIN是否经泛素化-蛋白酶体途径影响YAP的蛋白稳定性。7.应用Western blot技术,在HEK293T细胞以及Eca109食管鳞癌细胞系中通过泛素化及泛素位点实验检测SHARPIN对YAP蛋白稳定性调节的具体泛素化位点。结果:1.沉默Eca109食管鳞癌细胞系中的SHARPIN基因后,结果显示其蛋白水平、荧光水平、m RNA水平均明显下降,提示沉默成功。2.通过Transwell实验可观察到沉默SHARPIN后Eca109、KYSE150两种食管鳞癌细胞的侵袭能力明显增强,同时从Wound healing实验结果可观察到沉默SHARPIN后Eca109、KYSE150两种食管鳞癌细胞的伤口愈合速度明显增快。3.Western blot和q RT-PCR实验结果提示在Eca109、KYSE150两个食管鳞癌细胞系中沉默SHARPIN后,Hippo信号通路核心效应因子YAP的蛋白水平均明显增高,同时Hippo信号通路核心效应因子YAP的下游关键靶基因CTGF、CYR61的m RNA水平均明显升高。4.迁移和侵袭表型挽救实验提示沉默SHARPIN基础上同时沉默YAP后能逆转单纯沉默SHARPIN后Eca109、KYSE150两个食管鳞癌迁移侵袭能力增强的这一现象。Western blot、q RT-PCR实验结果提示同时沉默YAP可逆转单纯沉默SHARPIN后YAP蛋白水平以及其下游靶基因m RNA水平升高这一趋势。5.免疫荧光共定位实验表明在Eca109食管鳞癌细胞内SHARPIN与YAP共定位在细胞核。结构域实验表明SHARPIN蛋白与YAP蛋白可相互结合,且是SHARPIN的UBL结构域与YAP的171AA-292AA结构域相结合。6.CHX实验结果提示沉默SHARPIN后Eca109食管鳞癌细胞系中YAP的半衰期明显延长,而HEK293T细胞中过表达SHARPIN后YAP的半衰期明显缩短,MG132实验结果提示SHARPIN可能通过泛素化-蛋白酶体途径降解YAP蛋白。7.泛素化实验结果提示沉默SHARPIN后Eca109食管鳞癌细胞系中YAP蛋白的泛素化减弱,而过表达SHARPIN后HEK293T细胞中YAP蛋白的泛素化水平增强,同时泛素化位点实验提示SHARPIN可能通过K48泛素位点稳定YAP蛋白,而通过K63泛素化位点降解YAP蛋白。结论:本研究首次发现SHARPIN在人食管鳞癌细胞中可能发挥抑癌作用。SHARPIN可能作为Hippo/YAP信号通路新的调节剂,通过促进YAP-K48连接的泛素化方式促进YAP蛋白的降解,从而减弱食管鳞癌细胞迁移侵袭能力,提示SAHRPIN可能是食管鳞癌治疗的潜在靶点,可能为食管癌的精准治疗提供新的思路和策略。