第一部分丁苯酞抗血小板聚集作用及其机制的研究目的血管损伤时血小板活化参与损伤修复反应,对于生理止血过程十分重要。病理性条件下如动脉粥样板块自发性破裂或斑块侵蚀等,循环血液中的血小板异常活化形成动脉血栓将导致血管狭窄或闭塞,致使机体组织局部缺血或供血中断。这些是冠心病、急性冠脉综合征、缺血性脑卒中等当今威胁我国人民及许多发达国家人民健康的首要疾病的病理基础。随着对血小板功能研究的不断深入,研究表明抑制血小板活化的抗血小板药对冠心病、中风的预防、治疗效果肯定。丁苯酞(3-n-butylphthalide, NBP)是从芹菜籽中提取出来的特定成份并进行结构修饰而得到的新型化合物。2002年,丁苯酞(商品名为恩必普)获得中国SFDA批准,成为我国脑血管领域第一个拥有自主知识产权的一类新药。临床试验证实,口服制剂及针剂丁苯酞具有很强的抗脑缺血作用,对急性缺血性脑卒中的治疗有满意的疗效,同时副作用较小。2010年,丁苯酞软胶囊被编入我国《国家处方集》脑血管病指导用药,临床用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中的各个病理过程。以往的研究,使用体外、半体外比浊法证实丁苯酞对胶原、ADP、花生四烯酸诱导的大鼠血小板聚集有明显抑制作用；对大鼠灌胃给予丁苯酞后,观察到左旋体和消旋体丁苯酞可剂量依赖性地抑制大鼠血栓形成,并能使剪鼠尾后的出血时间延长2.1倍。然而,丁苯酞抗血栓、抗血小板作用的具体机制仍不明确。本研究对丁苯酞(消旋体及左旋体)体外抗人血小板聚集活性及其抗血小板的作用靶点进行了研究,从而对临床应用该药物给出一定的参考价值。方法实验时,我们当场采集健康志愿献血者的肘静脉全血。使用FITC-PAC-1标记血小板活化糖蛋白GPIIb/IIIa,通过全血法流式细胞仪检测丁苯酞对人血小板活化的作用；我们制备了未经阿斯匹林处理和经阿司匹林处理人的洗涤系血小板,用丁苯酞(消旋体及左旋体)处理血小板后,加入血小板激动剂ADP、凝血酶、胶原、U46619、花生四烯酸诱导血小板聚集,观察并记录其抗血小板聚集活性及对血小板ATP释放的影响；对其作用机制进行探讨时,我们使用柱层析法,加入[3H]腺嘌呤标记,检测丁苯酞对forsklin升高的ADP诱导的血小板内cAMP水平的影响；通过使用高效液相法检测酶反应体系中剩余底物的含量,进而反映丁苯酞对血小板提取的磷酸二酯酶(PDEs)活性的作用；此外,我们使用ELISA试剂盒,检测丁苯酞对ADP、凝血酶、胶原诱导的血小板内血栓烷A2生成的作用；最后,我们使用Fluo-3负载血小板,检测丁苯酞对ADP诱导的血小板内游Ca2+水平的影响。结果根据我们的实验结果,在全血条件下,丁苯酞(消旋体及左旋体)300μM可显著抑制由ADP10μM诱导的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化；在10-300μM范围中,丁苯酞(消旋体及左旋体)可可显著浓度依赖性地抑制由ADP10μM、凝血酶0.05U/mL、胶原1μg/mL、U466191μM、花生四烯酸0.5mM诱导的人洗涤血小板聚集和ATP释放；同时,我们观察到丁苯酞对ADP、凝血酶诱导的聚集的抑制作用,在未经阿司匹林处理条件下强于经阿司匹林处理条件,而丁苯酞对U46619诱导的聚集的抑制作用在经阿司匹林处理后反而相对更强,提示其抗血小板作用可能与抑制TXA2的生成有关；丁苯酞(消旋体及左旋体)300μM在从人血小板提取的磷酸二酯酶反应体系中,可显著增高酶底物cAMP的剩余含量,证明丁苯酞有抑制磷酸二酯酶的作用；此外,丁苯酞(消旋体及左旋体)30μM对ADP10μM诱导的血小板内cAMP降低的抑制作用无统计学差异,提示其作用靶点非P2Y12-Gi信号通路；’最后,在10-300μM的浓度范围内,丁苯酞浓度依赖性地显著抑制ADP、凝血酶和胶原诱导的TXA2生成；丁苯酞(消旋体及左旋体)100μM能够明显降低由ADP10μM诱导的血小板内Ca2+升高。结论1.丁苯酞(消旋体及左旋体)在体外对多种激动剂诱导的血小板激活具有较强的抑制作用。2.丁苯酞(消旋体及左旋体)抗血小板作用的机制主要为抑制TXA2的生成和抑制磷酸二酯酶。第二部分NOD2在血小板中的表达与功能的研究血小板是从骨髓来源巨核细胞上脱落下来的无核“细胞碎片”,流动于机体血液循环系统内。血小板的主要功能是参与凝血和止血,限制血管损伤处进一步出血。然而,血小板的异常激活将会导致急性冠脉综合征、缺血性脑中风等严重动脉血栓性疾病。此外,血小板与动脉粥样硬化、肿瘤生长和转移等病理过程有关联。活化的血小板能够表达分泌炎性因子如P-选择素及CD40L等。许多在白细胞表达的信号分子在血小板中也有表达。NOD作为白细胞表达的模式识别受体,在宿主抗侵入细菌的天然免疫(innate immunity)中具有重要作用。NOD主要有NOD1和NOD2。越来越多的证据表明,NOD2基因突变与炎症性肠疾病Blau综合征的发病有密切关联,也与克隆氏病的易感性增加相关。目前已知NOD2主要在单个核细胞中表达,但NOD2是否在血小板中表达,以及是否在血小板有功能均未见报道。我们首次发现血小板NOD2表达而且有功能。我们分别在mRNA水平及蛋白水平发现人及小鼠血小板表达高水平的NOD2,并发现野生型小鼠腹腔注射NOD2受体激动剂MDP,能够增强血小板激动剂ADP、thrombin、collagen诱导的小鼠血小板聚集及ATP释放,而NOD2受体敲除小鼠腹腔注射NOD2的激动剂MDP,不能增强激动剂ADP、thrombin、collagen诱导的血小板聚集及ATP释放。接着,我们检测了腹腔注射MDP对野性型及NOD2受体敲除小鼠血小板凝块收缩和血小板铺展的影响。结果显示,MDP能够显著加快野生型小鼠血小板凝块收缩速度,但是对血小板铺展没有明显作用；NOD2受体敲除小鼠MDP组与NS组血小板凝块收缩速度均相对减慢,两组间无明显差异；NOD2受体敲除小鼠MDP组与NS组血小板铺展亦无明显差异,并与野生型小鼠的血小板铺展面积相似。最后,我们还应用电镜分析血小板的形态结构,发现给予MDP刺激后野生型小鼠血小板明显具有活化趋势,而对NOD2受体敲除小鼠血小板的结构没有明显的影响。我们的结论是血小板表达NOD2,NOD2激活促进血小板活化。MDP激活NOD2后可能通过其下游MAPKs信号通路(包括p38、ERK、JNK)从而增强血小板的反应性,相关研究正在进行中。