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背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种神经退行性疾病,其发病率随着年龄增大而逐渐升高,我国65岁以上（含65岁）人群AD患病率高达4%-6%。AD患者治疗和看护费用严重消耗公共资源,可见AD将会给患者、家庭、社会和医疗带来沉重的负担。因此,AD发病机制的探索和防治策略的提出具有重要的社会意义。研究发现维生素D与认知水平存在关联,可能在AD的改善中具有重要生物学作用。既往对维生素D的研究多聚焦于VD活性对钙/磷代谢的调节作用,对于AD的研究仍存在不足,因此,本研究选择淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein,APP）/早老素 1（Presenilin 1,PS1）双转基因小鼠作为AD模型小鼠深入地探讨维生素D对AD的改善作用及机制研究。目的1 采用APP/PS1双转基因AD小鼠模型,研究维生素D3（Vitamin D3,VD3）干预对AD模型小鼠AD样病变及行为学改善作用。2 利用蛋白质组学技术,分析VD3干预对AD模型小鼠海马组织蛋白质表达的影响,探究其潜在分子机制。3 通过构建腺相关病毒（Adeno-associated Virus,AAV）载体,敲低AD模型小鼠海马组织中 MAPK 活化激酶 5（MAP kinase-activated Protein Kinases 5,MK5）及脱淀粉蛋白 DJ1（Protein Deglycase 1,DJ1）的表达,探究MK5/DJ1 传导在VD3改善AD样变中的作用。4 借助体外细胞实验,验证1,25（OH）2D3调控MK5/DJ1/核转录因子κB（Nuclear Transportation Factor κB,NFκB）通路对Aβ25-35诱导的小鼠海马神经元细胞（Hippocampal Neuronal Cell,HT22）的保护作用。方法1 探讨VD3对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的改善作用:将14周龄的雄性APP/PS1双转基因小鼠（100只）适应性喂养2周后,按照体重随机分为5组（n=20/组）:AD模型对照组（AD model control group,MC）、玉米油溶剂组（Corn oil vehicle group,CV）、VD3 高剂量组（60 IU/g·bw）（High dose vitamin D group,VD3-H）、VD3 中剂量组（30 IU/g·bw）（Middle dose vitamin D group,VD3-M）、VD3低剂量组（15 IU/g·bw）（LowdosevitaminDgroup,VD3-L）,每周肌肉注射1次。另设立同背景的C57BL/6J小鼠（20只）为空白对照组（Normal control group,NC）。干预20周后,通过旷场实验、高架十字迷宫、Morris 水迷宫、Barnes迷宫评价小鼠行为学变化。小鼠麻醉后,收集相应生物样本。通过酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定小鼠海马组织25（OH）D3含量;苏木素伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察海马组织病理变化;刚果红染色检测海马组织老年斑情况;蛋白组学探究海马组织蛋白质的差异表达;蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）检测海马组织中APP、Tau、MK5、DJ1、NFκB等蛋白表达水平;免疫荧光双染观察MK5和DJ1蛋白在海马组织细胞中定位。2 MK5/DJ1在维生素D3改善AD样变中的作用:运用AAV-shRNA干扰技术通过脑定位双侧海马组织CA1区构建MK5低表达和/或DJ1低表达型的APP/PS1双转基因AD模型小鼠。分组为MK5低表达组（MK5-）、DJ1低表达组（DJ1-）及MK5和DJ1共低表达组（MK5-+DJ1-）,并设立AAV-载体对照组（AAV-control group,AAV-C）,每组10只。维生素D3（30IU/g·bw/week）干预20周后,通过行为学实验评价小鼠行为变化;通过HE染色、刚果红染色评估小鼠海马组织病理学改变;通过WB实验检测小鼠海马组织内APP、Tau、MK5、DJ1、NFκB等蛋白的表达。3 基于MK5/DJ1/NFκB通路探讨1,25（OH）2D3对Aβ25-35诱导的HT22细胞的保护作用:通过50 nM的1,25（OH）2D3干预由40μM的Aβ25-35处理24 h的HT22细胞24 h,将细胞分为无处理的正常对照组（C组）、Aβ25-35处理的模型组（M组）、仅1,25（OH）2D3干预的维生素D组（D组）、1,25（OH）2D3和Aβ25-35共同处理的干预模型组（DM组）。采用ELISA实验检测细胞上清液中炎症因子水平,WB及免疫共沉淀检测各组细胞蛋白的表达。统计分析:所有符合正态分布的计量资料结果以均值（标准误）表示,两组之间均数比较采用独立样本t检验,多组之间均数比较采用单因素方差分析,进一步使用LSD-t检验进行两组间比较,重复测量资料采用重复测量方差分析,检验水准为双侧α=0.05。结果1 VD3对APP/PS1双转基因小鼠AD样变和行为学变化的改善作用:（1）海马组织VD3水平:与MC组150.74（1.07）pg/mg相比,VD3-L、VD3-M、VD3-H组小鼠海马内VD3水平增高,具有统计学差异（P＜0.001）,其中VD3-H组增高了2.5倍。（2）VD3干预对AD样变的影响:①小鼠海马组织HE染色结果显示,相较于NC组,MC组小鼠海马CA1、CA3区细胞深染;相较于MC组,VD3-L组CA1、CA3区细胞固化萎缩,VD3-M、VD3-H组小鼠海马CA1、CA3区细胞坏死明显减少。②刚果红染色结果显示,NC组呈阴性结果,MC组呈阳性反应,VD3-L组小鼠海马区刚果红阳性反应依然存在,VD3-M、VD3-H组相较于MC组着色区域明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。③WB实验结果显示,VD3-L、VD3-M、VD3-H组海马内APP、Tau蛋白表达降低,差异具有统计学意义（均P＜0.05）。（3）VD3干预对AD小鼠行为学变化的影响:①旷场实验中,VD3-M组小鼠进入中央次数高于MC组16.44（1.36）次（P＜0.001）且在中央区停留时间长于MC组31.89（1.33）秒（P＜0.001）。②高架十字迷宫实验结果显示,VD3-L、VD3-M、VD3-H组进入开臂次数高于MC组分别为3.33（0.49）次（P=0.016）、6.22（0.36）次（P＜0.001）、4.50（1.56）次（P＜0.001）。③Morris水迷宫实验结果显示,在空间探索实验中,VD3-M及VD3-H组小鼠平台穿越次数高于MC组（P VD3-M=0.012,PVD3-H＜0.001）,且潜伏期短于MC组（PVD3-L=0.002,PVD3-H＜0.001）。④Barnes迷宫结果显示,VD3各干预组小鼠进入目标孔次数较MC组高（PVD3-L=0.001,P VD3-M＜0.001,P VD3-H＜0.001）,且潜伏期较短（P VD3-L＜0.001,P VD3-M＜0.001,P VD3-H＜0.001）。（4）VD3干预对海马组织蛋白质组的影响:MC组与VD3-M组海马组织中筛选出34个差异表达的蛋白。其中,与MC组相比,有19个蛋白上调,15个蛋白下调。KEGG通路分析显示差异蛋白主要富集在MAPKs级联通路。（5）VD3干预对MAPKs级联通路蛋白表达的影响:WB实验结果显示,与MC组相比,VD3各干预组海马组织ERK1/2、MK5、DJ1蛋白表达上调（P＜0.05）,ox-DJ1、NFκB蛋白表达下调（P＜0.05）;免疫荧光共定位结果显示,相较于MC组,VD3-M干预后,MK5和DJ1强度增加。2 MK5/DJ1在VD3改善AD样变和行为学变化中的作用:（1）VD3对AAV注射后小鼠脑AD样变的影响:①HE染色结果显示,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ-组小鼠海马CA1、CA3区细胞深染。②刚果红染色结果显示,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ1-组刚果红染色斑块多于VD3-M组（P＜0.05）。③在MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ-组小鼠海马组织中APP及Tau蛋白表达相较于VD3-M组增加（均P＜0.05）。（2）VD3对AAV注射后小鼠行为学的影响:①旷场实验结果显示,与VD3-M组 16.44（1.36）次相比,MK5-组2.44（0.80）次、DJ1-组6.11（1.59）次、MK5-+DJ1-组8.67（1.98）次小鼠进入中央区域的次数减少（均P＜0.001）且持续时间较短（均P＜0.001）。②高架十字迷宫实验显示,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ-组小鼠在开臂停留时间及进入开臂次数较VD3-M组减少,差异均具有统计学意义。③在Morris水迷宫空间探索实验中,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ1-组小鼠平台穿越次数较VD3-M组1.50（0.22次）减少,分别为0.28（0.12）次、0.50（0.22）次、0.77（0.19）次,且潜伏期较长,差异具有统计学意义。④Barnes迷宫结果显示,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ1-组小鼠目标孔穿越次数较VD3-M组减少,且潜伏期较长,差异具有统计学意义。（3）VD3对MK5/DJ1传导相关蛋白表达的影响:WB结果显示,与VD3-M组相比,MK5-组、DJ1-组、MK5-+DJ1-组小鼠海马组织内MK5、ox-DJ1、ERK1/2表达降低（P＜0.05）,NFκB、APP、Tau蛋白表达升高（P＜0.05）。免疫荧光定位显示相较于VD3-M组各蛋白敲低组MK5和DJ1荧光强度减弱,且结合现象减少。3 1,25（OH）2D3对Aβ25-35诱导的HT22细胞的保护作用（1）ELISA实验结果显示,经1,25（OH）2D3干预,与C组相比,D组细胞中白细胞介素-6（Interleuκin-6,IL-6）和白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）蛋白表达降低（P＜0.05）,而M组中其表达量升高;与M组相比,DM组细胞中IL-6和IL-1β蛋白表达水平降低（P＜0.05）。（2）WB结果显示,与M组相比,DM组细胞中DJ1、p-MK5、ERK1/2蛋白表达显著增加（P＜0.05）,而NFκB、ox-DJ1蛋白表达显著降低（P＜0.05）。（3）免疫共沉淀结果显示,以MK5为诱饵蛋白,DJ1为目的蛋白,在M组中,检测到了诱饵蛋白MK5,但DJ1蛋白含量较低;在DM组中,既检测到了诱饵蛋白MK5,同时也检测到了DJ1蛋白。结论1 VD3干预能够有效缓解APP/PS1双转基因小鼠的认知功能障碍,改善AD样变。2 VD3改善AD小鼠海马认知功能可能与MAPK信号通路关联。3 VD3可能通过活化MK5和/或DJ1,来刺激MK5与DJ1的反应,从而抑制DJ1的胞外转移,减少DJ1氧化,进而改善APP/PS1小鼠行为学及AD样变。4 在1,25（OH）2D3干预Aβ25-35诱导的HT22细胞实验中,进一步印证MK5、DJ1蛋白的相互作用。