目的:视神经损伤再生及功能的恢复是眼科学临床科研亟待解决的难题,它是眼科疾病中致盲的主要病因之一。临床有许多研究证明视神经损伤后主要病理改变是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)轴索发生溃变,导致轴浆运输障碍最终使视网膜神经节细胞的水肿和凋亡[1]。因此目前的研究多集中在预防和减缓视网膜神经节细胞的凋亡和促进其再生两个方面。现阶段多局限在药物治疗为主,但是因许多药物的副作用和局限性,限制了在眼科的应用。所以当下如何寻找到一种不良反应少,而且对视神经有保护作用的药物成为世界眼科所面临的一个瓶颈。法舒地尔作为一种Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)抑制剂主要作用于抗血管的痉挛,适用于多种原因引起心脑血管的缺血性病变,主要变现在:缺血性脑卒中,短暂性脑缺血,基底动脉供血不足及缺血,蛛网膜下腔出血后引起的迟发性脑血管病,颅脑外伤后及治疗当中引起的脑血管的痉挛,脑出血后的修复期。目前有临床研究证明在脑损伤中法舒地尔可有效的抑制自由基的产生,改善脑血流量,并且对双侧阵发性颈总动脉痉挛引起的大鼠脑缺血后的继发性神经细胞损伤有抑制作用,保护神经元细胞。由近期研究来看法舒地尔已成为神经保护类药物的新的热点,但是对视神经的保护还罕有报道。本实验是制作大鼠视神经不完全损伤模型,通过观察视神经损伤后,未经处理的大鼠视网膜HE染色形态学改变,免疫组织化学染色半定量检测阳性细胞计数内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达状况,和腹腔注射法舒地尔后两者间的变化趋势。探讨法舒地尔在视神经损伤保护中的意义,旨在临床应用中提供实验和理论依据,从而为将来研究拓展新思路。方法:选取雄性SD大鼠60只作为研究对象,确保清洁及健康,质量(200±10)g(购买于河北医科大学动物实验中心),并对其外眼和眼底进行检查,正常者进入实验。随机进行分组:其中正常组12只大鼠双眼(24只),生理盐水组即对照组24只大鼠单眼(24只),法舒地尔组即治疗组24只大鼠单眼(24只)。不对正常组进行任何处理,治疗组和对照组均进行视神经钳夹法建立右眼视神经不完全损伤模型,分别对治疗组和对照组腹腔注射法舒地尔10mg/kg和等量的生理盐水,每日一次。分别于实验3天,7天,14天,21天摘除大鼠右眼球,随机抽取正常组3只大鼠摘除双眼(6只眼),治疗组和对照组分别随机各抽取6只大鼠摘除单眼(共12只眼),固定,包埋,切片,制备标本。以视盘上2mm范围内的视网膜作为观察对象,其中视网膜组织HE染色在光镜下观察视网膜细胞形态和数量的变化;免疫组织化学染色中观察视网膜组织中ET-1和HIF-1α的表达变化,计算机图像分析技术半定量检测视网膜组织中ET-1和HIF-1α的平均光密度值(Average optical density,AOD),以免疫染色阳性AOD值来表示抗原表达量,AOD值越高则阳性表达越强。实验结果均为正太分布计量资料,数据采用统计结果以均数±标准差表示,实验数据用SPSS13.0统计软件分析,同一组内的不同时间点数据运用单因素方差分析,不同组间同一时间点的数据进行独立样本t检验。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1视网膜组织HE染色光镜下相态1.1正常组由于大鼠未经视神经不完全损伤处理,视网膜HE染色后可见视网膜结构层次分明,从内向外依次为视网膜神经节细胞层(RGCs层)、双极细胞层、感光细胞层。视网膜神经节细胞层细胞排列整齐规则,其余两层排列紧密,染色均匀,细胞形态规整,细胞未见病理学改变。1.2对照组损伤3天后,各别细胞出现空泡变样改变及水肿,神经节细胞层排列紊乱,内核层及外核层也有不同程度变薄;损伤7天后,整个视野出现多数空泡样改变,神经节细胞层胞核明显稀少,胞核呈固缩状态,包浆染色不均,水肿加重。内、外核层细胞排列疏松、紊乱。损伤后14天视网膜的大部分神经节细胞可见空泡样改变,胞核溶解包浆淡染,细胞数目明显变少,水肿有加重趋势。内、外核层的细胞紊乱程度加重。损伤后21天视网膜的细胞病理学改变较3-14天进一步加重。1.3治疗组损伤后3天,视网膜轻微水肿,各层结构未见明显变化,内、外核层细胞间隙稍微增大,和对照组比较,细胞间隙小,排列紧密、规整。损伤7天视网膜水肿加重,各层细胞排列紊乱,细胞间隙增大,出现空泡样变性,但较对照组轻。损伤14天,多数细胞排列整齐,水肿好转,和对照组比明显减轻。损伤后21天,视网膜各层形态改变趋于平稳状态,形态优于对照组。有此可得出各时间点治疗组视网膜各层细胞的形态、数量和水肿程度和对照组比较均明显减轻,但较正常组差。2视网膜神经节细胞数量变化正常组平均RGCs数无明显差异,无统计学意义;对照组3、7、14、21天平均RGCs数为17.430±1.448、12.055±0.778、7.903±0.800、3.903±0.794个;治疗组3、7、14、21天平均RGCs数为21.305±1.558、15.342±1.439、10.336±0.826、6.830±0.799个(每×400倍光镜视野)。由此可见,视神经损伤后对照组、治疗组RGCs数目均呈下降趋势,但治疗组RGCs数均高于对照组RGCs数,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。3免疫组化结果3.1视网膜组织中ET-1的表达在大鼠视网神经节细胞层、内核层表达,呈棕黄色染色。在正常视网膜组织中ET-1呈弱阳性表达平均光密度值为0.142±0.027,各时间点无变化。对照组在损伤后的3天、7天、14天时ET-1平均光密度值为0.270±0.038、0.350±0.037、0.290±0.037,均较正常组升高,具有统计学意义(P<0.01),7天后表达相继平缓,14到21天时有所下降,21天平均光密度值为0.256±0.037。治疗组与对照组相比,在损伤后各时间点ET-1的阳性表达较对照组均明显减弱,平均光密度值分别为0.250±0.039、0.303±0.035、0.224±0.035、0.174±0.035,有统计学意义(P<0.01),但均强于正常组。3.2视网膜组织中HIF-1α的表达呈棕黄色染色,主要表达在视网膜的内、外丛状层和外核层的胞浆中。其在正常视网膜组织中HIF-1α无明显阳性表达,各时间点显著显变化。对照组HIF-1α在损伤后3天表达开始升高,7天时表达升高明显,14天上升平缓开始下降,直至21天仍高于正常组,平均光密度值分别为0.137±0.029、0.212±0.028、0.358±0.034、0.284±0.029,各时间点较正常组均具有统计学意义(P<0.01)。治疗组与对照组相比,在实验的3天、7天、14天、21天HIF-1α的阳性表达均明显降低,平均光密度值分别为0.113±0.029、0.193±0.029、0.316±0.032、0.254±0.029,具有统计学意义(P<0.01)。结论:1视神经损伤初期出现视网膜神经节细胞的损伤和凋亡,腹腔注射法舒地尔可以减轻视网膜神经节细胞的损伤,对视神经损伤后有一定的保护作用。2由上述实验表明视神经损伤后视网膜的ET-1的表达显著升高,说明ET-1参与了视神经损伤的过程,而法舒地尔可以有效地抑制ET-1的升高,发挥视神经保护作用。3视神经损伤后视网膜神经节细胞的HIF-1α的表达明显高于正常组,证明HIF-1α参与了视神经损伤的过程,腹腔注射法舒地尔抑制了HIF-1α的表达,表明法舒地尔对视神经的保护和抑制HIF-1α的表达有关系。4通过以上结果说明法舒地尔对视神经损伤修复有促进作用。