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苹果是我国栽培面积最大的经济树种，但缺铁黄叶病严重地限制了苹果的大规模生产和其经济产量。因而研究和克隆缺铁胁迫相关基因不仅为进一步研究苹果吸收、转运铁的分子机制提供基础。其次，在提高植物对铁胁迫抗性的遗传育种中，可以利用基因工程技术，将铁胁迫相关基因整合到作物染色体基因组中，从而达到有效控制铁营养的目的。 本试验以苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材，利用玉米Fe(Ⅱ)转运蛋白基因片段以及小麦金属反应元件结合蛋白TaMRE-BP cDNA为探针，筛选小金海棠缺铁根cDNA表达文库，目的在于克隆苹果铁高效基因型小金海棠的Fe(Ⅱ)转运蛋白基因以及与缺铁胁迫相关的结合蛋白基因。主要结果如下： 1、用标记的玉米Fe(Ⅱ)转运蛋白基因片段为探针，对约120000Pfu的文库进行筛选，经过三轮筛选，最后获得4个单一的阳性克隆cDNA，分别命名为pTF1、pTF2、pTF3和pTF4。选其中两个有代表性的克隆进行测序分析。 2、根据测序的结果，将所得序列在GenBank中进行同源性比较，结果如下：pTF1长为494bp，pTF2长为763bp，分别编码88个和172个氨基酸，属于小金海棠Fe(Ⅱ)转运蛋白基因的两个不同长度的基因片段，是同一个基因。 3、Southern杂交分析表明：Fe(Ⅱ)转运蛋白基因在小金海棠基因组中可能是单拷贝；同时证明山定子和珠眉海棠基因组DNA中也存在类似基因。 4、Northern杂交分析结果表明：Fe(Ⅱ)转运蛋白基因在缺铁和正常供铁的小金海棠根系中均表达，且随缺铁处理表达量加强，特别是缺铁6天的根系RNA杂交信号最强，由此也可以推测，小金海棠Fe(Ⅱ)转运蛋白基因对缺铁胁迫响应。 5、用小麦金属反应元件TaMRE-BP cDNA作探针，筛选小金海棠缺铁根cDNA表达文库，通过对约120000Pfu的文库进行三轮筛选，共获得10个阳性克隆。选其中片段较长的两个克隆进行5’端测序，结果表明：两个克隆所编码的蛋白均与拟南芥的一个MYB蛋白具有高度同源性，从中选择片段最长的一个克隆(定名为MxMyb1)进行全序列测定。 6、测序结果表明，MxMyb1全长1134bp，5’非翻译区116bp，3’非翻译区112bp，ORF含302个氨基酸，推测其分子量为33二KD，是一个具有完整阅读框的全长的MYB类转录因子基因。＊XM如1仅有一个＊＊B重复区：与拟南芥以响b蛋白的IR序列的同源性最高，达86。9％，与马铃薯 StMyb的 IR序列的同源性达 77．0％，所有这些 NnrB蛋白除了瓜区具有较高的同源性外，其 C端和 N端几乎没有同源性。MWYB蛋白的 C一端还含有一个富含脯氨酸区，这样的结构基序可能具有激活转录的功能。 7、虽然 MYB基因是一个转录因于大家族，但我们通过 Soutnern杂交验证：MxMyb基因在小金海棠基因组DNA中是单拷贝。实验中为了避免由于保守的MYB结构域而造成该基因和同类转录因于的杂交，所用探针仅用MxMybl基因C一端的特异性片段。 8、NOrthCm杂交结合RTpCR的方法对MxMybl基因在小金海棠中的表达模式进行了分析，结果如下：MxMyb在根系和叶片中均表达，缺铁处理可以加强MxMybl在根系中的表达，尤其是缺铁3天的根系表达量最强。 9、对转录因子 Mttiyb基因进行原核表达载体的构建及其蛋白的原核表达。构建的原核表达载体结构正确，未出现碱基突变及移码现象；lmmoffe IPTG诱导 Zh后，在预期的蛋白分子量约38kDa处出现一条表达加强的蛋白带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。