论文部分内容阅读
甲壳素(Chitin)是一种可再生的天然高分子多糖。因其良好的生物活性、相容性以及可降解性,所以它在伤口愈合和组织修复领域有许多应用。但是甲壳素不溶于一般的溶剂,严重制约了其在各个方面的应用。最近几年关于改性甲壳素用于加速伤口愈合的研究很多,但是关于其结构与活性的关系的研究相对较少。 本文综述了甲壳素的结构、甲壳素的衍生化反应以及甲壳素及其衍生物在促进伤口愈合修复中的研究进展,在此基础上分别采用Tempo/NaBr/NaClO体系选择性氧化及双氧水降解甲壳素制备了一系列水溶性的具有不同分子量的6-羧基甲壳素和甲壳素低聚糖,并通过MTT以及ELISA实验,研究了这些甲壳素衍生物的细胞增殖及细胞因子表达的活性,探讨了结构和活性之间的关系。主要研究结果如下:(1)采用 NaOH/尿素处理甲壳素使其晶形由α型转变为β型,再用Tempo/NaBr/NaClO选择性氧化甲壳素6位羟基为羧基,成功制备了一系列分子量从0.46×104-7.70×104的6-羧基甲壳素,并采用 FT-IR、NMR、GPC、XRD等分析手段表征了分子结构。此外对制备条件进行了优化。实验结果表明,影响6-羧基甲壳素得率以及分子量的主要因素是次氯酸钠与溴化钠。其反应时间最优应当控制在1h、次氯酸钠为144ml、Tempo为96mg、NaBr为4.8g时其产物得率为84.25%分子量6.0×104。通过MTT实验研究了6-羧基甲壳素对细胞增殖的影响,实验结果表明6-羧基甲壳素可以促进成纤维细胞以及表皮细胞的增殖且表现出浓度依赖性,在100μg/ml的浓度下6-羧基甲壳素对成纤维细胞的增殖作用最强,越低浓度的6羧基甲壳素对促进表皮细胞(HaCaT)的活性越强。分子量也影响着它们的活性,作用于表皮细胞其分子量越低表现的活性越强,而对于人皮肤成纤维细胞(HSF)分子量在1.21×104-6.00×104间其活性最强。通过ELISA实验研究了6-羧基甲壳素对细胞因子分泌的影响,结果表明,当不同分子量的6-羧基甲壳素的浓度为100μg/ml时对成纤维细胞及巨噬细胞进行刺激后,它可以促进巨噬细胞分泌TGF-β和PDGF,它们的含量随着分子量的增加而降低。但是6-羧基甲壳素却抑制了成纤维细胞 TGF-β以及bFGF的表达,且其抑制率也受分子量影响。这些活性可以说明特定分子量的6羧基甲壳素可用做伤口敷料中的活性材料。 (2)通过NaOH/尿素体系溶解甲壳素制备均相甲壳素溶液,制备出不同分子量的甲壳素低聚糖其分子量3.48×103-3.35×104。结果表明,更久的静置预处理时间可以提高甲壳素低聚糖的得率。其得率最高可达95.5%,但预处理时间对产物的分子量没有多大影响。温度的升高,双氧水投加量的增加,以及反应时间的增加都可以使产物的分子量降低、得率提高,并且使产物的颜色加深。在MTT实验中也发现甲壳素低聚糖在100μg/ml的浓度下,对人皮肤成纤维细胞(HSF)的促进增殖效果最佳。而分子量3.48×103-1.64×104的甲壳素低聚糖对 HSF促进增殖效果最佳。而甲壳素低聚糖对表皮细胞(HaCaT)总体上来说起到抑制其增殖的作用且受其分子量影响。在 ELISA实验中巨噬细胞加药刺激后巨噬细胞分泌的 TGF-β和 PDGF与对照组相比有着明显的提高。并且甲壳素低聚糖的分子量也影响这两种因子的分泌,较低分子量的甲壳素低聚糖活性比高分子量的高。但甲壳素低聚糖对HSF分泌TGF-β主要起到抑制作用,而不同分子量对TGF-β的分泌影响不大。另外,它对PDGF分泌几乎没有影响。但它却抑制了HSF的bFGF说明成纤维的增殖可能是因为低浓度的TGF-β所引起的。