化疗作为肿瘤治疗的重要手段之一,虽然使许多肿瘤患者获益,但疗效仍难以让人满意。肿瘤细胞的原发性和获得性耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。研究表明,Bcl-xL的高表达与肿瘤细胞化疗抵抗呈极强的正相关。脱氧核酶作为一种新型的基因治疗工具,在一定条件下切割mRNA分子中配对嘧啶和未配对嘌呤之间的磷酸二酯键,抑制基因转录和翻译,调控目标蛋白的表达。本课题针对Bcl-xL mRNA,设计合成一种具有高效抑制性及特异性的“10-23”型脱氧核酶DT882,在不同肿瘤细胞系中证明其能够抑制Bcl-xL表达和逆转肿瘤化疗抗性细胞对化疗药物的抵抗性,通过人前列腺癌移植瘤模型体内研究其化疗增敏活性。研究表明,靶向Bcl-xL脱氧核酶具有显著的抑制肿瘤生长和化疗增敏效应,是一种有效的化疗增敏剂,在癌症药物治疗中具有潜在的应用价值。第一部分目的：靶向Bcl-xL脱氧核酶的设计、筛选和生化分析。方法：利用生物信息学获得81个Bcl-xL mRNA可切割位点,针对每个位点进行杂交自由能分析,得到26个潜在的靶位点。依据筛选出的靶位点,按“10-23"型设计脱氧核酶,进行1+1,3+3,5+5硫代修饰,分析三种修饰脱氧核酶在血清中的稳定性。单循环反应,以Kobs为参数,对三种硫代修饰脱氧核酶进行动力学分析。运用体外切割反应筛选具有切割活性的脱氧核酶。结果：1+1,3+3,5+5三种硫代修饰脱氧核酶在血清的稳定性分析发现,脱氧核酶稳定性随着被修饰碱基数增加而增加,而其切割效率却随着碱基数的增加呈下降趋势。综合分析我们采用3+3硫代修饰方式。运用体外切割反应筛选出10个具有Bcl-xL mRNA切割活性的脱氧核酶。结论：体外成功筛选出10个具有Bcl-xL mRNA切割活性的脱氧核酶,为后期脱氧核酶细胞内生物活性筛选提供实验基础。第二部分目的：分析Bcl-xL脱氧核酶对靶基因的抑制作用。方法：以TMP为转染试剂将初次筛选出的10种脱氧核酶转染至PC3细胞,免疫印迹检测各种脱氧核酶的生物学活性,筛选出对Bcl-xL抑制效果最显著的脱氧核酶。将筛选出的Bcl-xL脱氧核酶经TMP转染至不同肿瘤细胞株(前列腺癌细胞PC3、膀胱癌细胞T24、非小细胞肺癌细胞A549以及鼻咽癌细胞CNE1),免疫印迹验证其在不同肿瘤细胞中的生物活性。结果：免疫印迹检测发现转染脱氧核酶DT882、DT883、DT884组与转染试剂组相比Bcl-xL蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。综合体外切割和细胞活性数据。我们选定脱氧核酶DT882作为后期研究对象。将DT882转染至不同肿瘤细胞株中发现,脱氧核酶DT882转染组与对照组(Scrambled DT882)相比,Bcl-xL的表达明显被抑制(P<0.05)。结论：TMP能高效的将脱氧核酶DT882递送到细胞内,准确找到靶位点,抑制Bcl-xL表达。第三部分目的：研究Bcl-xL脱氧核酶对细胞凋亡的诱导作用以及相关机制。方法：将前期筛选出的Bcl-xL脱氧核酶DT882和对照脱氧核酶(Scrambled DT882)经TMP分别转染至人前列腺癌细胞PC3和鼻咽癌紫杉醇化疗抗性细胞CNE2R中,分别命名为DT882组、Control组。同时设立未转染空白对照组及转染试剂TMP组,分别命名为cell组和TMP组。转染48h后用Annexin V/PI染色,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。按上述分组,将DT882转染至PC3细胞,48h提蛋白,免疫印迹检测凋亡相关蛋白细胞色素c的表达变化。结果：流式检测凋亡率显示在PC3细胞和CNE2R细胞中DT882组凋亡率都明显高于Control组(P<0.05)。PC3细胞转染Bcl-xL脱氧核酶后,免疫印迹检测显示DT882组Bcl-xL表达明显低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),相对应的细胞色素c的表达较Control组增高(P<0.05)结论：Bcl-xL脱氧核酶通过抑制Bcl-xL表达,促进细胞色素c的释放,诱导细胞凋亡。第四部分目的：研究Bcl-xL脱氧核酶对肿瘤化疗增敏效应。方法：(1)体外分析靶向Bcl-xL脱氧核酶增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。实验分七组进行分别是：antisense control组(AS)、DNAzyme组(DT882)、negative control组(Scr Ctr),AS、DT882、 Scr Ctr分别与紫杉醇结合组(AS+Taxol、DT882+Taxol、Scr Ctr+Taxol)以及Taxol组。按以上分组对不同组织来源的肿瘤细胞进行处理,MTS检测各组细胞的存活率,根据(untreated-treated)/untreatedx100%计算细胞的死亡率,按照[(DT882+Taxol)-Taxol]/Taxol x100计算化疗增敏指数(Sensitization index)。通过比较Sensitization index分析脱氧核酶DT882对肿瘤细胞的化疗增敏效应。(2)MTS分析Bcl-xL脱氧核酶逆转鼻咽癌紫杉醇抵抗细胞CNE2-Taxol对紫杉醇的抵抗性：将CNE2R细胞以3*103的密度种于96孔板中,第二天将DT882经Lip200转染至CNE2R细胞中,6h后分别以0、10、20、40nM的紫杉醇浓度处理细胞,转染48h后MTS法检测细胞存活情况。同时设立只加紫杉醇处理组和Control组,每组至少设三个复孔。计算各组细胞的存活率,以紫杉醇浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标绘制细胞存活曲线。(3)裸鼠成瘤实验研究Bcl-xL脱氧核酶的体内化疗增敏效应：实验分七组进行,依次是生理盐水组(Saline)、脱氧核酶组(DT882)、antisense control组(AS)、紫杉醇组(Taxol)、紫杉醇分别与Saline、DNAzyme、AS联合组(Taxol+Saline、Taxol+DT882、Taxol+AS)。应用前列腺癌细胞PC3接种于雌性Balb/c裸鼠成瘤,待肿瘤体积达20-30mm3时,腹腔植入Alzet泵,泵药速度是0.25ul/h,泵药14天后,需要紫杉醇处理组每周按25mg/kg浓度腹腔注射紫杉醇。从处理当天开始用游标卡尺精确测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。(4)分析脱氧核酶体内稳定性及Alzet泵对脱氧核酶的递送效率：从肿瘤组织、裸鼠血浆以及Alzet泵中提取脱氧核酶,经γ-32P-ATP由T4核酸激酶标记后,最后通过PAGE分析DNAzyme体内稳定性和Alzet泵给药效率。结果：(1)所研究的七种不同组织来源的肿瘤细胞系经Bcl-xL脱氧核酶处理后其化疗敏感指数均超过140%,并且在乳腺癌细胞MDA-MB-231高达266%。(2) CNE2R组和Control组用不同浓度紫杉醇处理未见细胞凋亡,脱氧核酶转染组(DT882组)经不同浓度紫杉醇处理后细胞存活率明显降低。(3)以时间为横坐标、肿瘤体积为纵坐标做相关曲线,发现Alzet泵可缓释脱氧核酶14天(种植肿瘤后第22天)再腹腔注射紫杉醇后,肿瘤体积逐渐缩小,而其他组的肿瘤呈不断增长趋势。(4) PAGE分析显示脱氧核酶在血浆中的含量最高,其次是肿瘤组织中,而在Alzet泵中含量甚微。结论：Bcl-xL脱氧核酶在体内稳定存在,抑制肿瘤生长,逆转肿瘤化疗抗性细胞对化疗药物的抵抗性。