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目的:研究Rap1GAP在粘附连接(Adherent junction AJ)形成过程中所发挥的作用。Rap1GAP是小分子G蛋白Rap1的GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein),它可以加速rap1由活化形式(与GTP结合)转变为去活化形式(与GDP结合)。许多研究表明活化形式的Rap1可促进粘附连接的形成。有研究表明Rap1GAP能抑制粘附连接的形成甚至使已形成的粘附连接破坏,但也有研究的研究者发现Rap1GAP并不能够抑制粘附连接的形成,而只是延迟了粘附连接形成的过程。因此Rap1GAP在粘附连接形成过程中的作用及其机制有待进一步研究。由于粘附连接的破坏与上皮细胞间质化(Epithelial myofibroblast transition EMT)以及肿瘤的转移均有密切的联系,因此这一研究有助于增进我们对肿瘤转移机理的了解,并为临床上肿瘤的防治提供新的药物作用靶点。方法:1)脂质体试剂法将编码Rap1GAP或GFP的质粒转染到293细胞和Hela细胞,用G418筛选稳定表达Rap1GAP的293和Hela细胞系(293-Rap1GAP,Hela-Rap1GAP)以及稳定表达GFP的293和Hela细胞系( 293-GFP, Hela-GFP) ,对筛选后得到的克隆用荧光显微镜技术和Westernblot技术进行鉴定。2 )绘制293-Rap1GAP、Hela-Rap1GAP、293-GFP、Hela-GFP、293和Hela细胞的生长曲线,观察Rap1GAP对细胞增殖的影响。3)相差显微镜和免疫荧光技术观察293 -Rap1GAP细胞间的粘附。4)将Gαz和Rap1GAP共转染到293细胞,观察Rap1GAP在细胞中的定位;荧光显微镜技术观察在钙离子螯合实验过程中Rap1GAP在293 -Rap1GAP细胞中的定位。5)免疫荧光技术观察钙离子螯合实验过程中Rap1GAP和N-钙粘蛋白在293 -Rap1GAP细胞中的定位。6)免疫荧光技术观察钙离子螯合实验过程中Integrin-β-1在293 -Rap1GAP细胞中的定位。结果:1)荧光显微镜观察及westernblot实验结果证实了G418筛选后获得了稳定表达Rap1GAP或GFP的293和Hela细胞系。2)生长曲线实验结果显示293-Rap1GAP的增殖速度比293-GFP和293慢, Hela-Rap1GAP的增殖速度与Hela-GFP和Hela细胞无差别。3)293 -Rap1GAP成片状生长,N-钙粘蛋白集中分布于细胞间粘附部位。4)Rap1GAP能在外源的活化型Gαz的作用下向细胞间的粘附部位聚集;而且在EGTA作用30min时,Rap1GAP可自发地向细胞间的粘附部位聚集。5)钙离子螯合实验结合免疫荧光技术结果显示:(a)293-Rap1GAP的粘附连接在EGTA作用60min后才被破坏,而293-GFP的粘附连接在EGTA作用15min后即被破坏。(b)293-Rap1GAP和293-GFP的粘附连接在恢复钙离子浓度30min后均完全恢复,两组间无明显差异。(c)EGTA作用前Rap1GAP主要分布于胞浆,EGTA作用15、30、45min时Rap1GAP向细胞间粘附部位聚集,EGTA作用60min时Rap1GAP又主要分布于胞浆,恢复钙离子浓度15min时Rap1GAP向细胞间粘附部位聚集,恢复钙离子浓度30min时Rap1GAP又主要分布于胞浆。6)Integrin-β-1定位于细胞间粘附部位, EGTA对Integrin-β-1参与构成的连接无影响。结论:研究结果表明:1)获得了稳定表达Rap1GAP或GFP的293和Hela细胞株。2)Rap1GAP抑制宫颈癌细胞系Hela的增殖,而不抑制293细胞的增殖。3)Rap1GAP不能破坏293细胞的粘附连接。4)RapGAP可以向细胞间粘附部位聚集。5)聚集到细胞间粘附部位的RapGAP可以拮抗EGTA对粘附连接的破坏,但对粘附连接的形成无影响。6)Integrin-β-1是293细胞紧密连接的组成分子之一。