1.目的：p53基因与肿瘤的发生密切相关,在所有恶性肿瘤中,50%以上会出现该基因的突变。人们普遍认为P53起到抑制细胞增殖的作用,但在肝细胞中发现抑制P53功能的同时也抑制了细胞增殖。提示P53对于细胞增殖具有促进作用。最近有文献报道P53是人源性或鼠源性TGFa的转录起始因子,同时P53也可以激活MAPK途径,提示P53有促进细胞增殖作用。本研究主要探索P53促进细胞增殖的机理。2.方法：2.1细胞提取和培养雄性成年Wistar大鼠,重200～220克,饲养在12小时阳光12小时黑夜条件下。肝原代细胞使用改良的体外胶原酶灌注两步分离术提取。细胞死亡由台盼蓝染色计数。细胞种植密度为20000个/cm2。无血浆培养液由Williams Medium E培养基和Dulbecco’s modified Eagle’s medium按等比例混合,最终葡萄糖浓度为8.4mmol/L。培养基中加入青霉素(67mg/L),链霉素(100mg/L),地塞米松(25nmol/L)和胰岛素(100nmol/L)。在种植前3个小时使用5%血浆培养基培养。然后使用无血浆培养液培养在37℃,5%C02条件下。实验使用10nmol/L的EGF刺激细胞。2.2Western Blotting检测蛋白培养的肝原代细胞使用Tris-lysis buffer (pH7.4,含60mmol/L的Tris-HCl,10%甘油,3%的硫酸钠(SDS), lmol/L的EDTA,0.2mmol/L的AEBSF,20μmol/L亮肽素,200U/mL的抑肽酶,65μmol/L钒酸钠和10mmol/L的β-甘油磷酸)裂解。然后裂解液进行超声。所有样本的蛋白浓度使用DC protein assay检测(Bio-Rad, Hercules, CA, USA),并调整到相同浓度,最终加入p-巯基乙醇和溴酚蓝并使它们的浓度分别为5%和0.0025%。样品煮上4分钟并贮存于-20℃条件下。样品蛋白进入凝胶电泳分离并转移至硝化纤维膜上进行随后的分析。硝化纤维膜使用含5%牛奶的Tris-buffered saline溶液封闭,然后使用含1%牛奶的Tris-buffered saline的一抗溶液4℃孵育过夜。实验中使用以下抗体：鼠源性的抗Cyclin E抗体和抗P53抗体,购自Cell Signalling Technology公司,兔源性的抗Cyclin D1抗体和鼠源性的抗P21抗体,购自Upstate Biotechnology公司,抗Thr202/204位点磷酸化的Erk抗体和抗CDK4抗体,购自Cell Signalling Technology公司,鼠源性抗(3-tubulin抗体,购自Sigma-Aldrich公司,购自Fitzgerald公司,兔源性抗pYl173位点磷酸化的EGF受体抗体。冲先后,硝化纤维膜孵育二抗溶液90分钟,二抗为HRP连接的山羊源性抗兔IgG抗体和驴源性抗鼠IgG抗体及驴源性抗绵羊性IgG抗体,购自Sigma Aldrich公司。荧光使用加强的化学荧光(ECL)法检测。2.3放射渗入法检测细胞增殖肝细胞在六孔板上如上培养。细胞种植后48小时加入氚标记的胸苷(1μCi/ml)。 DNA合成程度由检测到的细胞吸收的放射性胸苷来表示。六孔板由三氯乙酸冲洗两次,每次10分钟。剩下的细胞由0.3ml的1mol/L KOH溶解,放射性由液体闪烁仪计数。蛋白浓度测定如上2.4ELISA检测TGFa浓度收集培养液并根据ELISA法说明步骤检测TGFa(灵敏度为5pg/ml)浓度。将针对TGFa膜外部分抗原决定族和整个TGFa分子抗原决定族的多克隆抗抗体固定到检测板上(捕获抗原),冲洗检测板,将同量的不同组的样品与羊抗人源性的TGFa抗体混合,然后加到检测板上。3小时孵育后,冲洗检测板3次后漂洗1次去除未与检测板结合的物质。链霉卵白素-过氧化物酶孵育样本30分钟。冲洗3次和漂洗1次后,在无光环境下发色底物邻苯二胺孵育样本后使用硫酸终止反应。使用TGFa干粉和蒸馏水及缓冲液配制的250,125,and63pg/ml及其它合适浓度溶液作为标准浓度,分光光度计在490nm检测样本浓度。为了排除操作过程中溶液含有影响检测的因子,同时检测由缓冲液和操作溶液等比例混合配制的浓度为63,125,250pg/ml和其它合适浓度的标准液。所有的检测使用相同的处理步骤。2.5免疫荧光检测蛋白细胞内分布4%甲醛溶液固定新鲜的细胞样品10min。PBS溶液冲洗2×10min后,室温干燥30min,待样品表面无多余液体后加一抗至细胞表面,置于湿盒内,室温孵育过夜。然后PBS溶液冲洗2×10min,加荧光标记二抗溶液至细胞表面,置于湿盒内,室温孵育1小时。然后PBS溶液冲洗2×10min,室温干燥30min,待样品表面无多余液体后,将盖玻片固定在载玻片表面,使用共聚焦显微镜进行观察(60×油镜)。3结果3.1P53与细胞增殖1)EGF刺激细胞后激活P53功能在培养液中添加EGF刺激细胞24小时或30小时后,细胞中P21的表达升高；而P53抑制剂pifithrin-α可以完全阻断EGF诱导生成P21。上述结果表明EGF刺激细胞后可激活P53,进而促进转录生成P21。2) Cyclin D的表达依赖P53激活在培养液中添加EGF刺激细胞24小时和30小时后,细胞中Cyclin D的表达升高,而P53抑制剂pifithrin-α可以阻断此一过程。结果显示Cyclin D的生成依赖P53的激活。3)P53与细胞增殖的剂量反应关系按在肝细胞EGF刺激1小时前使用P53抑制剂及抑制剂浓度分组,细胞受EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。结果显示P53抑制剂pifithrin-α可以抑制EGF诱导的肝细胞增殖,pifithrin-α浓度与细胞增殖存在剂量反应关系,当pifithrin-α浓度高至30μmol/L时,将完全抑制肝细胞的增殖。4)P53与细胞增殖的时效关系按加入P53抑制剂pifithrin-α到细胞培养液的时间点分组,EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。在EGF刺激细胞1小时前或第12小时使用pifithrin-α,肝细胞增殖将会完全受到抑制,而第24小时使用pifithrin-α则细胞增殖受到部分抑制。结果显示,P53激活对细胞增殖的影响主要发生在EGF刺激细胞12小时后。3.2P53促进细胞增殖的机制1)细胞分泌TGFα依赖P53激活EGF刺激肝细胞后24小时收集培养液,使用ELISA检测培养液中TGFα的水平(以三次实验结果的均数表示)。结果显示在未给予EGF刺激的肝细胞培养液中TGFα于8pg/ml,而在EGF刺激的肝细胞培养液中TGFα为38.24pg/ml。而如果在给予EGF刺激前1小时应用P53抑制剂pifithrin-α,则培养液中的TGFα为12.3pg/ml。所以EGF刺激细胞分泌TGFα依赖P53的激活。2) TGFα与细胞增殖的剂量反应关系EGF刺激细胞30小时后使用放射渗入法检测细胞的增殖水平。按在肝细胞EGF刺激1小时前使用中和抗体及抗体种类浓度分组,检测各组细胞的增殖情况。结果显示TGFα中和抗体可以抑制肝细胞增殖,而当TGFα中和抗体浓度高至0.5mg/L时,将完全抑制肝细胞的增殖。说明肝细胞自分泌的TGFα和细胞增殖存在剂量反应关系。分别将对照抗体和TGFα中和抗体与EGF混合溶解于100u1培养液中,1小时后将此混合液分别加入正常的肝细胞培养液中,10分钟后使用WESTERN BLOTTING法检测细胞的EGF受体和ERK1/2的磷酸化水平。结果显示,TGFα中和抗体与EGF的混合液并未影响EGF受体和ERK1/2的磷酸化水平,说明TGFα中和抗体与EGF并未发生特异性的交叉反应。3) TGFα与细胞增殖的时效关系在EGF刺激细胞后不同时间加入TGFα抗体中和培养液中细胞分泌的TGFα, EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。结果显示,在EGF刺激细胞1小时前或第12小时使用TGFα中和抗体,肝细胞增殖将会完全受到抑制,而在第24小时使用TGFα中和抗体,则细胞增殖受到部分抑制。说明细胞分泌的TGFα主要在EGF刺激细胞12小时后起作用,与P53促进细胞增殖具有相同的时效关系,提示P53通过TGFα促进细胞增殖。3.3TGFα促进细胞增殖的机制1) TGFα促进Cyclin D表达TGFα促进细胞增殖的作用主要发生在EGF刺激细胞12小时后,因此在EGF刺激细胞12小时后加入培养液TGFα中和抗体,在24小时和30小时收获细胞。结果显示,TGFα中和抗体抑制Cyclin D的表达,说明细胞分泌的TGFα起到促进Cyclin D表达的作用。证实了P53抑制Cyclin D的表达是通过TGFα实现的。2) TGFα促进Cyclin D细胞核内分布Cyclin D的功能也依赖其在细胞内的分布,当EGF刺激细胞30小时后,Cyclin D和CDK4均位于细胞核内,而如果不给予细胞EGF刺激,则Cyclin D和CDK4均位于细胞质内。当使用鼠源性的TGFα单克隆抗体中和培养液中细胞分泌的TGFα后,Cyclin D口CDK4与不给予EGF刺激细胞的情况相似,仍位于细胞质中未进入细胞核内,说明细胞分泌的TGFα起到促进Cyclin D和CDK4细胞核内聚集的作用。4.结论EGF刺激肝原代细胞后可引起P53蛋白激活,P53进入细胞核后促使TGFα基因进行转录,转录生成的TGFα可由细胞分泌到细胞外,TGFα可与EGFR受体结合刺激细胞,诱导Cyclin D蛋白合成和细胞核内聚集,促进细胞增殖。