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目的:胰腺导管干细胞（Pancreatic duct stem cells,PDSCs）是位于胰腺导管组织内的成体干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能。PDSCs不但能通过体外分离培养建系,为胰腺干细胞的发育和分化机制研究提供材料,还能通过建立诱导培养体系,促进PDSCs分化形成功能性胰岛,移植治疗糖尿病。目前,干细胞定向分化形成胰岛β细胞已成为研究热点。但是,由于定向分化机制不明确,最佳诱导体系尚在探讨中。本课题组已从成年大鼠胰腺导管组织分离培养一例大鼠胰腺导管干细胞（rPDSCs）系,研究了rPDSCs的表达特征、核型及分化多能性等。本研究选用ATRA、Exendin-4和DAPT三种添加物,体外诱导rPDSCs分化为类胰岛细胞（Islet-like cells,ILCs）,探索最佳诱导体系,为促进干细胞诱导分化形成胰岛和诱导胰岛移植治疗糖尿病提供理论依据和细胞来源。方法:将浓度为2×10~4个/m L的rPDSCs扩增至单层,对照组采用基础培养液DMEM/F12+10%FBS+1%双抗,在此基础上,实验组分别添加2、4、6和8μM ATRA,5、10、15和20 n M Exendin-4以及5、10、15和20μM DAPT,诱导28d,将rPDSCs诱导分化为ILCs,比较各组诱导效果,筛选单因子最适诱导浓度。采用ATRA、Exendin-4和DAPT最适诱导浓度的不同组合体外定向诱导rPDSCs分化形成ILCs,筛选最适诱导组合。在单因子最适诱导浓度和最适诱导组合的基础上,再采用Matrigel、悬浮和悬滴培养方式,诱导rPDSCs分化形成ILCs,筛选最佳培养方式。通过倒置显微镜观察诱导期间细胞形态变化,双硫腙染色鉴定诱导ILCs胰岛素颗粒,免疫荧光染色和q PCR检测诱导ILCs中β细胞关键蛋白和基因表达,糖刺激试验评估诱导ILCs的成熟和功能性,筛选建立较优诱导培养体系。结果:ATRA诱导浓度的筛选:2、4、6和8μM ATRA处理组均能诱导rPDSCs分化形成ILCs。在诱导过程中,不同浓度ATRA处理组rPDSCs在诱导过程中由多角形上皮样分化形成形态完整的胰岛样球形细胞团,其中6μM ATRA处理组形成的ILCs团簇数量更多;各ATRA处理组ILCs DTZ染色结果均呈阳性,在蛋白水平均共表达Insulin和Pdx1,其中,6μM ATRA处理组较其他组的Insulin和Pdx1基因表达以及胰岛素和C肽分泌水平均显示上调。因此,ATRA能诱导rPDSCs分化形成ILCs,且在基础培养液中添加6μM ATRA时诱导效果最好。Exendin-4诱导浓度的筛选:5、10、15和20 nM Exendin-4处理组均能诱导rPDSCs分化形成ILCs。在诱导过程中,不同浓度Exendin-4处理组rPDSCs由多角形聚集生长,分化形成大小不一的团簇状,其中10 n M Exendin-4处理组产生的团簇更大,形态更完整,且具有包膜结构;不同浓度Exendin-4处理组ILCs的DTZ染色结果均呈阳性,在蛋白和基因水平共表达Insulin和Pdx1,其中10n M Exendin-4处理组表达量最高;10 n M Exendin-4处理组ILCs的胰岛素和C肽释放量较其他组显著升高（P＜0.01）。因此,Exendin-4能诱导rPDSCs分化形成ILCs,且在基础培养液中添加10 n M Exendin-4时诱导效果最好。DAPT诱导浓度的筛选:5、10、15和20μM DAPT处理组均能诱导rPDSCs分化形成ILCs。在诱导过程中,不同浓度DAPT处理组rPDSCs均分化为密集分布的ILCs团簇,以10μM DAPT处理组细胞团分布密集度更高;DAPT处理组ILCs DTZ染色结果均呈阳性,证明了ILCs内部胰岛素颗粒的存在;DAPT处理组均在蛋白水平共表达Insulin和Pdx1,可以看出10μM DAPT处理组的ILCs更大更亮,共表达量更高;10μM DAPT处理组ILCs的Insulin基因表达显著高于其他组（P＜0.01）,Pdx1基因表达显著高于15μM和20μM DAPT处理组（P＜0.05）;10μM DAPT处理组的胰岛素和C肽释放量较其他组均显示上调。因此,DAPT能诱导rPDSCs分化形成ILCs,且在基础培养液中添加10μM DAPT时诱导效果最好。ATRA、Exendin-4和DAPT组合形式筛选:A+E、A+D、E+D和A+E+D联合诱导组均能诱导rPDSCs分化形成ILCs。在诱导过程中,各联合诱导组rPDSCs由鹅卵石样分布的多角形细胞分化形成不规则的克隆团簇,边界清晰,细胞团周围形成包膜结构,其中A+E+D联合诱导组的成团现象最明显;各联合诱导组ILCs DTZ染色结果均呈阳性,以A+E+D联合诱导组的染色效果更接近原代胰岛,且均在蛋白水平共表达Insulin和Pdx1,E+D和A+E+D联合诱导组ILCs蛋白共表达更高,成熟性更好;A+E+D联合诱导组ILCs的Insulin和Pdx1基因表达极显著高其他组（P＜0.01）;与前三部分试验中各添加物最佳诱导组相比,A+E+D联合诱导组的胰岛素和C肽释放量都最高,ILCs的功能性是最能反映诱导效果的指标,由此,我们得到最优添加物组合诱导体系,即在基础培养液中添加6μM ATRA+10 n M Exendin-4+10μM DAPT为最适诱导组合。不同诱导培养方式的筛选:采用不同培养方式均能诱导rPDSCs分化形成ILCs。Matrigel培养、悬浮培养和悬滴培养组rPDSCs均分化形成形态不同的胰岛样结构;各诱导组ILCs DTZ染色结果均呈阳性并在蛋白水平显示共表达Insulin和Pdx1,以单层培养下的最佳诱导组为对照,Matrigel培养组无论是mRNA水平还是葡萄糖反应性均显示高于其他组。因此,采用Matrigel培养可以对诱导效果进一步优化。结论:在Matrigel培养方式下,采用DMEM/F12+10%FBS+1%双抗+6μM ATRA+10n M Exendin-4+10μM DAPT体外诱导rPDSCs分化形成ILCs的效果最佳,诱导形成类胰岛细胞团,DTZ染色结果呈阳性,在蛋白质和mRNA水平上共表达Insulin和Pdx1,5m M葡萄糖刺激下,胰岛素和C肽释放量分别为95.20 m U/L和3154.97 pg/m L,25m M葡萄糖刺激下,胰岛素和C肽释放量分别为109.44m U/L和3509.82 pg/m L。