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背景造血分化是生物体内重要的生理过程,不仅涉及造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSC)的自我更新、各链系祖细胞的定向分化,还包括祖细胞向成熟血细胞分化和发育的全过程。红系分化和巨核系分化是造血分化的重要分支,也是贯穿人一生的重要生理过程。转录因子Eos也叫IKZF4 (ikaros family zinc finger 4),是锌指蛋白转录因子ikaros家族中的一员。作为负性调节因子可以参与许多基因的表达调控。有研究表明,Eos也参与了造血过程中红系的分化,但作用机制还不清楚。而关于Eos在巨核系分化中的作用及其机制知之更少。目的分析转录因子Eos在红系和巨核系分化中的作用,并初步探讨其调控机制。方法1.细胞培养：将生长状态良好的K562细胞分为红系诱导组和巨核系诱导组进行传代培养。前者传至4个中号培养皿中,分别标记为Oh、12h、24h、8h4个时间段,加入50μM氯化高铁血红素(Hemin)。后者传至6个中号培养皿中,分别标记为0h、12h、24h、48h、 72h、96h,6个时间段,加入50pM佛波酯(PMA)。在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,诱导K562细胞分别向红系和巨核系分化。2.联苯胺染色与瑞氏-姬姆萨染色：收集各组细胞,1000 rpm离心5min,收集沉淀,用胎牛血清重悬,涂片染色,镜下观察细胞的形态变化。3.流式细胞检测：收集各培养组细胞,检测诱导前后细胞分化相关表面标志物CD41a、CD61、CD235a、CD71的表达情况。4. Real-time PCR检测：收集细胞,提取RNA,检测诱导后Eos mRNA的表达量。5. Western blot蛋白检测：收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,Western blot检测诱导前后转录因子Eos和红系特异转录因子GATA-1蛋白的表达情况。结果1.K562细胞经PMA诱导后瑞氏-姬姆萨染色,随着诱导时间的延长细胞形态发生明显变化,细胞体积变大,核越来越大,大核细胞增多,这些结果进一步显示PMA诱导K562细胞巨核系分化成功。2.K562细胞经Hemin诱导后,随红系分化过程Eos蛋白和mRNA表达水平逐渐下降。3.K562细胞中过表达Eos,然后经Hemin诱导48h后,流式结果显示红系细胞表面标志CD71、CD235a的表达量明显低于对照组,说明Eos对K562细胞红系分化有抑制作用。4.过表达Eos的K562细胞经Hemin诱导48h后,联苯胺染色显示细胞红系分化的阳性率明显低于对照组,进一步说明Eos蛋白对红系分化有抑制作用。5.K562细胞经PMA诱导后Eos蛋白表达水平逐渐下降,GATA-1蛋白水平逐渐升高。6.K562细胞经PMA诱导后,巨核系细胞表面标志CD41a、CD61表达量随诱导时间延长而升高,说明PMA对K562细胞的巨核系分化诱导成功。结论Eos蛋白在Hemin诱导的K562细胞向红系分化过程中起抑制作用,Eos蛋白在巨核系分化过程中显著降低,过表达Eos蛋白在巨核系分化过程中的作用我们试验正在进行中。