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我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中筛选得到一条的cDNA,经生物信息学分析发现其包含TPR(TetratricoPeptid.Repea.domain)保守结构域,将其命名为家蚕BmTPRn基因。家蚕B.TPRn基因是我们在家蚕中首次发现的一个TPR蛋白超家族基因,它只含有一个外显子;家蚕BmTPRn基因cDNA长为135.bp,ORF大小为85.bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31.1kD,等电点为4.75。
本实验根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增出目的基因,插入融合表达载体pET-28a(+),成功构建重组表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。终浓度为0.5mM的IPTG诱导后裂解菌体做SDS-PAGE分析,在35kD处有特异性蛋白条带,与预测值相符。成功的通过Ni-NTA柱亲和层析得到纯化的重组蛋白。用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价在1:1.800以上。提取家蚕各时期及组织的RNA,设计特异引物利用RT-PCR检测BmTPRn在转录水平上差异。结果表明:BmTPRn基因在卵巢中的转录水平明显高于其他的组织;在各时期中,基因BmTPRn在蛹的转录水平最高。提取家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个时期及五龄幼虫的头、卵巢、丝腺等组织的总蛋白,进行免疫印迹实验,结果显示,在五龄幼虫的卵巢中BmTPRn基因表达量明显高于其他组织和RT-PCR的实验结果相一致,在头中没有检测到表达信号。BmTPRn蛋白在家蚕五龄幼虫、蛹、蛾均检测到表达信号。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,BmTPRn蛋白在细胞核与细胞质当中均有分布。我们推测BmTPRn基因是家蚕重要的生殖发育相关的基因。这些结果为深入研究家蚕BmTPRn基因的功能奠定了基础。