前言 抑郁症发病率逐年增加，对人类的健康和生命已构成威胁，并引起人们的广泛的关注。既往对抑郁症发病机制的研究长期局限于突触受体水平神经递质含量的变化，目前研究资料证实抑郁症病人有海马结构和功能的变化，近来有研究表明神经元细胞的凋亡可能参与这种海马结构和功能的损害。目前有关神经元细胞凋亡的研究大多集中在脑缺血、脑缺氧等方面，有关精神应激后神经元凋亡的研究少有报导。因此深入研究应激与海马神经元细胞凋亡的关系，揭示应激损害海马的机制，找到有效地阻断或逆转措施，保护海马神经元，将具有很重要的意义和临床应用价值。 因此本实验以慢性应激制作抑郁症动物模型，初步探讨慢性应激、抑郁症、海马神经元细胞凋亡之间的关系。 实验材料 一、实验动物 成年Wistar雄性大鼠20只(由中国医科大学动物实验室提供)，平均体重200g。 二、仪器 YSD-4G型药理生理多用仪、Morph／Cool Snapfx／Ax70图像分析仪。 三、主要试剂 TUNEL原位杂交试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒、兔抗鼠Bcl-xl抗体，购于Boster公司。DAB显色剂由Sigma公司生产，Boster公司分装。实验方法一、动物分组 大鼠适应环境一周后采用旷场分析(Open一Field)法测定行为并称重。然后随机分为对照组(5只)，和实验组(15只)。二、动物抑郁症模型的制备 对照组每笼养5只，实验组每笼1只。实验组参照文献，共接受21天各种不同的刺激，包括:电击足底、冰水游泳、热应激、摇晃、夹尾、禁水、禁食、每天给予一种刺激，每种刺激至少给予2次。对照组不接受任何刺激，自由摄食饮水。 三、标本制备 在实验第22天杀死实验组和对照组。各组大鼠在被处死前均采用Open一Field法测定大鼠的行为并称体重。测定后采用灌注固定，断头、取脑并修块。将脑修块置于4%多聚甲醛溶液中固定48小时以上，梯度酒精脱水，石蜡包埋。 四、海马神经元细胞凋亡的测定 1.用TuNEL原位标记染色，通过图像分析仪分析单个视野下阳性神经元的细胞个数和所占切面面积比。 2.凋亡调控因子的检测通过免疫组化染色，用图像分析仪分析单个视野下阳性神经元的细胞个数和所占切面面积比以及平均目标灰度值。 五、统计学分析: 以上试验结果均采用SPSS for杭ndows 10.0软件分析，组间采用t检验，P值取0.05。实验结果 一、动物行为观察 旷场分析中和对照组比较，实验组大鼠经过21天应激后，方格穿行次数、站立次数减少，差异有显著性，P<0 .01;修饰次数也有类似的变化，两组间差异有显著性，P<0.05;中央格停留时间明显增加，差异有显著性，P<0.01;粪便粒数明显增加，差异有显著性，P<0 .05。 二、体重变化 经过21天慢性应激后，实验组体重显著低于对照组，差异有显著性，P<0.01。 三、海马中细胞凋亡的情况 1.TUNEL染色在实验组及对照组海马各区均可以观察到细胞核被染成棕黄色的凋亡细胞，但两者有显著差异。从凋亡细胞所占比例、凋亡细胞计数来看，实验组均显著高于对照组，P<0 .01。 2.免疫组化染色在实验组及对照组海马各区均可以观察到细胞质被染成棕黄色的阳性细胞，但两者有显著差异。从阳性细胞所占比例、阳性细胞计数来看，对照组均显著高于实验组，P<0 .01;从平均灰度值来看，较对照组比较，实验组明显增加，P<0 .01。讨论 评价一个抑郁症模型的制作是否成功，主要依据动物在行为上的变化，旷场行为分析就是用来检测大鼠在新异环境中行为的变化。旷场行为中中央格停留时间反映动物的认知能力，穿越格次数反映动物的兴奋性，直立次数和修饰次数反映动物对环境的适应程度和满意程度，粪便粒数反映动物的紧张程度。本模型中动物经21天慢性综合性应激后，其活动明显减少、紧张程度增加、兴趣丧失，这些表现与抑郁症患者所表现的精神运动性抑制、兴趣的改变有很大程度的相似性，表明本实验中大鼠抑郁症模型的制作是成功的。 慢性应激可以诱发抑郁症这在本实验中得到了很好的印证。但慢性应激诱发抑郁症的机制仍未完全阐明。研究发现，慢性应激时海马结构存在器质性改变。在对抑郁症病人的研究中，发现抑郁症患者海马存在与慢性应激大鼠相似的整体形态的改变。因此人们认为慢性应激引起海马结构和功能的紊乱，而导致抑郁症的发作。 目前的研究结果显示，应激可以导致海马神经元缺失、海马体积减少。神经元缺失一般有坏死和凋亡两种形式，到底是哪种形式参与应激对海马的损害，目前尚有争论。 本研究中TUNEL染色可见实验组大鼠和对照组相比较，整个海马以及各亚区在应激后凋亡细胞计数及所占切面面积的百分比增加。 本研究中采用的TUNEL染色法能快速检测出单个凋亡细胞，但其特异性差，容易受到细胞坏死的影响而成假阳性，但研究发现，细胞凋亡是受自身基因调控的。Bcl一过是目前备受关注的凋亡调控因子，它主要?