论文部分内容阅读
研究背景:SHP2是由Ptpn11基因编码的一种典型的、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,它包含2个SH2结构域、1个PTP结构域和1个C-端区域。野生型SHP2,N端的SH2结构域与PTP结构域结合,使SHP2处于一个自我抑制状态。SHP2发生自身激活突变可以破坏其自我抑制状态而导致持续激活,它存在于多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤中。SHP2在不同类型恶性肿瘤中,突变率不同,激活突变首先在血液系统恶性肿瘤中被发现,其突变率为7.52%,随着研究的拓宽,在实体瘤中也发现SHP2突变,与高发实体瘤相关的研究报道有肺癌、肝癌、乳腺癌等,但是搜索COSMIC（catalogue of somatic mutations in cancer）数据库后,我们发现SHP2在上述实体瘤中的突变率都很低,肺癌为1.79%,肝癌为0.47%,乳腺癌为0.15%,而实体瘤中SHP2突变率最高的是结直肠癌5.75%,仅次于血液系统恶性肿瘤的7.52%。SHP2E76K激活突变是SHP2最活跃的突变位点E76中比较常见的,且在相关数据库中也查询到了结直肠癌临床病例中确实存在E76K的突变位点。结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤,它的发病率有很大的地区差异,其中北美、大洋洲发病率最高,其次欧洲,在亚非地区比较低,但是,随着我国国民饮食习惯的改变,高脂高蛋白食物的摄入增加,结直肠癌的发病率在我国呈逐年上升的趋势,我国南方,特别是东南沿海明显高于北方。关于结直肠癌的序列演变过程,研究人员已经有了比较深入的了解,其经典的演变过程是正常肠上皮细胞-增生/微小腺瘤-早、中、后期腺瘤-癌-癌转移。这一演变过程的不同阶段有不同的分子机制参与,而结直肠癌的进展和转移与上皮间质样转变（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）密切相关。EMT在肿瘤的浸润和转移过程中起着枢纽作用。发生EMT的上皮细胞会进一步失去极性,与周围组织和相邻细胞的连接变弱,向具有活动能力的间质细胞转变,从而获得侵袭和迁移的能力,导致肿瘤的局部浸润和远处转移。EMT的发生也与多种信号通路有关,如TGF信号通路,Notch信号通路,Wnt信号通路,其中Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌发生发展中发挥了重要作用。Wnt信号通路是胚胎发育所必需的经典信号途径之一,它的重要性被人们逐渐认识,它可以决定生物体许多重要的生命环节,比如细胞迁移、极化、神经形成以及胚胎发育过程中器官的发生。但是,随着研究的深入,研究者发现Wnt信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展有着密切关系。并且根据已有报道,Wnt/β-catenin信号通路是EMT发生的一个关键诱导因素。研究目的:探讨SHP2的最常见突变位点E76K,对临床常见结直肠癌的发生和进展有何影响,并进一步分析与结直肠癌进展密切相关的EMT以及Wnt/β-catenin信号通路在其中发挥了怎样的作用。研究内容:第一部分SHP2E76K和SHP2WT促进结肠癌细胞的恶性生物学行为及SHP2在结直肠癌患者中高表达1.构建SHP2E76K和SHP2WT质粒,并包装成慢病毒。2.用病毒悬液感染结肠癌细胞系HT29和HCT116,并用嘌呤霉素筛选,建立SHP2E76K和SHP2WT的稳转细胞系。3.进行一系列的体外实验观察实验组结肠癌细胞恶性生物学行为的改变1)MTT实验检测HT29和HCT116细胞株的增殖情况,并绘制生长曲线;2)Transwell迁移实验观察HT29和HCT116细胞株的迁移能力;3)平板克隆实验观察HT29和HCT116细胞株的克隆形成能力;4)软琼脂实验观察HT29和HCT116细胞株的的非锚定生长能力;4.将稳转细胞株HT29接种到裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内的增殖成瘤能力。第二部分SHP2E76K和SHP2WT促进结肠癌细胞恶性生物学行为的机制研究1.通过细胞形态观察,是否有EMT发生;2.通过相关实验来验证EMT发生:1)通过western blot来检测EMT相关标志物改变;2)通过免疫荧光来进一步检测EMT典型标志物改变;3.通过western blot和免疫荧光研究诱导EMT发生的Wnt/β-catenin信号通路是否参与;4.通过β-catenin siRNA来进一步验证Wnt/β-catenin信号通路在SHP2E76K和SHP2WT诱导EMT中的作用5.裸鼠实验观察稳转细胞株在裸鼠体内的转移情况。第三部分SHP2E76K对结肠炎相关性结直肠癌发生的影响1.Ptpn11E76K基因敲入小鼠与pVillin-Cre工具鼠配繁及基因型鉴定2.通过AOM/DSS诱导结肠炎相关性结直肠癌模型研究结果:第一部分SHP2E76K和SHP2WT促进结肠癌细胞的恶性生物学行为1.成功构建了SHP2E76K激活突变及SHP2WT病毒,并建立SHP2E76K激活突变及SHP2WT的HT29和HCT116结肠癌稳转细胞株;2.SHP2E76K激活突变及SHP2WT促进了结肠癌细胞系的体外增殖、克隆形成、迁移能力和裸鼠体内的成瘤能力;第二部分SHP2E76K和SHP2WT促进结肠癌细胞恶性生物学行为的机制研究1.EMT参与了SHP2E76K激活突变及SHP2WT促进的结肠癌进展过程;2.Wnt/β-catenin信号通路参与了SHP2E76K激活突变及SHP2WT诱导EMT的发生。3.SHP2E76K激活突变及SHP2WT促进了结肠癌细胞株在裸鼠体内的肝转移能力。第三部分SHP2E76K对结肠炎相关性结直肠癌发生的影响1.成功繁育及鉴定出Ptpn11E76K和pVillin-Cre双转基因小鼠;2.SHP2E76K能够加重小鼠的炎症反应及促进结肠炎相关性结直肠癌的发生;结论:SHP2E76K激活突变及SHP2WT可以增加结肠癌细胞系的恶性生物学行为和裸鼠成瘤能力及肝转移能力,并引起由Wnt/β-catenin信号通路介导的EMT的发生,并且在结肠炎相关性结直肠癌的发生中也起了重要作用。