随着农业经济的发展,农药的出现给人们的生活提供了巨大的便利。然而,农药的大量使用对人类和动物的生存环境也造成了潜在的威胁。灭多威（Methomyl,MET）是一种氨基甲酸酯类广谱杀虫剂,被广泛应用于蔬菜、粮食、水果、棉花等作物。MET也是一种内分泌干扰物,1997年被世界野生动物基金会列为环境雌激素（Environmental estrogen,EE）。MET已经被证实会对动物产生各种毒性,同时也会影响人类健康。目前关于MET的研究很多,但是关于MET对雌性哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育的报道却很少。本研究的目的是以小鼠作为试验动物模型,从体外探索MET对卵母细胞以及早期胚胎发育的毒性作用,从而为哺乳动物生殖疾病提供一定理论依据。本研究共分为以下两部分:第一部分:灭多威对小鼠卵母细胞成熟的影响本研究探讨了MET对小鼠卵母细胞成熟的影响及潜在机制。首先,探讨了小鼠卵母细胞对MET梯度浓度的敏感性,并利用第一极体排出率作为标志。结果发现,60和100μM MET处理后第一极体排出率明显降低,200μM MET处理后卵母细胞全部致死。为了进一步探究MET对卵母细胞成熟的影响,本研究又利用免疫荧光染色检测了小鼠卵母细胞内氧化应激状态、纺锤体形态和线粒体功能,利用q RT-PCR检测了凋亡相关基因的表达。结果显示,60μM MET组卵母细胞内超氧阴离子自由基显著增加。经MET处理后,小鼠MI期卵母细胞出现纺锤体形态异常。同时,MET组卵母细胞的线粒体膜电位降低,导致小鼠卵母细胞成熟能力下降。此外,MET也可以诱导细胞凋亡,具体表现为促凋亡基因Bax和Caspase-3的mRNA表达升高。结果表明,MET可以引起卵母细胞发生氧化应激和细胞凋亡,干扰小鼠卵母细胞的成熟。第二部分:灭多威对小鼠早期胚胎体外发育的影响研究表明,即使在极低的浓度下,EE对早期胚胎也会产生毒性作用,甚至对胚胎的后续发育也会造成致命伤害。在本次研究中,探讨了MET对小鼠早期胚胎体外发育的作用及其机制。首先,通过药物MET处理小鼠早期胚胎体外培养24 h或96 h,通过形态学观察,统计早期胚胎的2细胞率及囊胚率。利用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR等方法,检测了早期胚胎的囊胚总细胞数及细胞凋亡率、活性氧水平、线粒体膜电位、LC3蛋白表达、谷胱甘肽含量、γ-H2A.X表达水平以及抗氧化相关基因的表达。结果发现,不同浓度MET组早期胚胎的2细胞率与对照组相比没有显著差异,但添加30μM MET可以显著降低囊胚率。MET增加氧化应激并损害线粒体功能,这可能是囊胚率降低的原因。30μM MET可促进囊胚的细胞凋亡,降低囊胚总细胞数。此外,MET处理后早期胚胎自噬水平以及DNA损伤程度明显升高,抗氧化相关基因Sod2、Cat和Gpx3的mRNA表达显著降低。研究结果表明,MET处理降低了早期胚胎体外发育能力,通过引起氧化应激,破坏线粒体功能来发挥其毒性作用。综上所述,本研究表明MET会对小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育产生毒性作用,具体表现为第一极体排出率和囊胚率降低。MET引起的氧化应激、纺锤体形态异常,抑制了卵母细胞成熟;MET还可以诱导自噬和DNA损伤,降低早期胚胎的发育能力。