磷脂酶A2（PLA2, E.C.3.1.1.4）能够特异性地水解甘油磷脂分子的第2位酰基,生成自由脂肪酸和溶血磷脂,具有多种生理学活性,从而广泛参与人体细胞的代谢和调节。根据蛇毒PLA2第49位氨基酸的不同,主要分为D49PLA2和K49PLA2。D49PLA2含有一个钙离子结合环,大多具有较强的酶活性。K49PLA2为碱性蛋白,无钙离子结合环,大多几乎没有或者有较弱的酶活性。钙离子是PLA2发挥酶活性必须的辅助因子,与其药理学活性有重要关系,但作用机制目前还不明确。因此,关于钙离子对PLA2结构与功能的关系研究有重要意义。本研究以竹叶青蛇毒TS-G6D49PLA2为材料,用基因工程方法表达TS-G6D49,并通过设计一系列突变体,研究PLA2与钙离子结合部位结构,钙离子与PLA2结合的性质,以及钙离子对PLA2的构象和功能的影响。为了制备TS-G6D49蛋白,采用融合蛋白EDDIE表达方法,构建重组克隆载体pMD18-T-EDDIE-TS-G6D49和重组表达载体pET-30a-EDDIE-TS-G6D49,成功表达EDDIE-TS-G6D49蛋白。在变复性的过程中,EDDIE-TS-G6D49融合蛋白复性效果不理想。改为利用NdeI的后三位碱基作为起始密码子,构建重组克隆质粒pMD18-T-TS-G6D49和重组表达质粒pET-30a-TS-G6D49.转化E. coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测,在大约14kDa处有条带。经超声波破碎,T riton X-100洗涤,用8M尿素变性及尿素浓度梯度透析的方法复性,经HPLC纯化,SDS-PAGE检测为一条带。纯化的PLA2酶活性用滴定法通过测定水解产物脂肪酸的方法检测,结果表明表达纯化的TS-G6D49的酶比活力为0.3814μmol×min-1×mg-1。 TS-G6D49属于sPLA2,可能具有sPLA2典型的由H48、Y52、Y73和D99组成的酶活性位点,和由Y28、G30、G32和D49组成的钙离子结合环。为了研究钙离子对PLA2的结构与功能的影响,围绕钙离子结合位点和活性位点的结构,设计了五个突变体,M-1（Tyr28Asn）, M-2（Asp49Lys）, M-3（Tyr28Asn; Asp49Lys）, M-4（Asp49Asn）和M-5（Tyr28Asn; Gly30Ala; Asp49Asn）.通过定点突变的方法获得突变后的重组克隆质粒,Dpn I消化模板质粒,构建重组突变表达载体,转入E. coli BL21（DE3）, IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测突变蛋白质得到表达。为研究Ca2+对PLA2的结构与功能提供理论基础。