论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒。在我国它是导致肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因。HBeAg是由HBV DNA前-C基因与C基因区共同编码的一种非颗粒性的分泌蛋白，随HBV复制而增加，临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一。 为研究HBeAg在HBV感染后病毒致病过程中的作用，我们以分子生物学技术构建HBeAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBeAg，以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBeAg转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术，构建HBeAg激活相关基因差异表达的。DNA消减文库，筛选相关的靶基因片段，将产物与T/A载体连接，构建CDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆多聚酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。对转染后的细胞裂解液同时应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析。筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、蛋白质翻译合成、肿瘤、神经系统发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索，并发现一个未知功能的基因，命名为HBeAg反式激活蛋白(HBeAgTP)。 在新基因功能的研究方面，我们对HBeAgTP进行了初步探讨。从人肝癌细胞中得到了HBeAgTP基因的全长编码序列，构建与绿色荧光蛋白融合的表达载体PEGFP一HBeAgTP，通过基因与荧光蛋白基因融合表达，明确它的亚细胞定位主要在细胞浆。进一步应用酵母双杂交技术筛选HBeAgTP与肝细胞文库结合的蛋白，包括一些与细胞内蛋白质的翻译、免疫调节及物质和能量代谢相关的基因。对该基因的功能进行初步研究，为下一步更加具体的生物学功能、基因表达调控的深入研究开辟道路。