暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）是一种典型的江海洄游性鱼类,在其生活史中对外部生态环境的敏感度较高。近年来,伴随着市场需求量的逐年增长,及养殖规模的不断扩大,暗纹东方鲀在经济鱼类市场占据的地位越来越重要。本实验室前期的研究发现,养殖水体中新型污染物纳米铜（Copper Nanoparticles,Cu-NPs）和传统的硫酸铜(Cu SO₄,简称Cu²⁺)暴露都影响了暗纹东方鲀肝脏内质网稳态,但其机制尚不清楚。目前,在污染物产生毒性作用的过程中,内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）及其介导的未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）和Ca²⁺稳态扮演着重要的角色。因此,本研究以此为切入点,首先在暗纹东方鲀肝脏克隆了ERS相关基因;其次,比较了水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露下暗纹东方鲀组织病变的程度;最后,分别探究了水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露下暗纹东方鲀肝脏中UPR信号通路及Ca²⁺稳态的响应情况。本研究不仅进一步揭示了暗纹东方鲀ERS相关基因及其介导的信号通路在Cu-NPs和Cu²⁺暴露下的响应机制,还为评估新型污染物Cu-NPs对水生生物的毒性影响提供了有价值的参考资料,为暗纹东方鲀的健康养殖提供了理论基础。具体研究结果如下:1.暗纹东方鲀ERS相关基因的分子特征及组织表达分析利用RACE技术扩增获得暗纹东方鲀GRP78、CRT、PERK、ATF-6α和IRE-1α基因全长序列。结果表明,GRP78基因的c DNA全长为2542 bp,其中开放阅读框（ORF）为1963 bp,编码653个氨基酸,5’和3’UTR区分别为140 bp和439bp;CRT基因的c DNA全长为1583 bp（Gen Bank登录号:MN 580497）,其中ORF为1293 bp,编码430个氨基酸,5’和3’UTR区分别为131bp和159 bp;PERK基因的c DNA全长为5374 bp,其中ORF为3303 bp,编码1100个氨基酸,5’和3’UTR区分别为151 bp和1920 bp;ATF-6α基因的c DNA全长为3505 bp,其中ORF为1947 bp,编码648个氨基酸,5’和3’UTR区分别为144 bp和1414 bp;IRE-1α基因的c DNA全长为3805bp,其中ORF为3228 bp,编码1075个氨基酸,5’和3’UTR区分别为181 bp和396 bp。氨基酸序列比对结果显示,暗纹东方鲀这五个基因与同属的红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）同源性最高。系统进化分析结果显示,暗纹东方鲀这五个基因均与同属的红鳍东方鲀共聚一支,表明暗纹东方鲀这五个ERS相关基因在进化过程中高度保守。采用荧光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）技术检测了暗纹东方鲀GRP78、CRT、PERK、ATF-6α和IRE-1α基因在七个不同组织（脑、脾、肠、肌肉、鳃、皮肤和肝）的表达情况。结果表明,这五个基因在肝组织均有高表达,而在皮肤中表达丰度最低。因此,肝脏可能是内质网应激相关基因行使其功能的靶器官。2.水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露下暗纹东方鲀肝脏和鳃组织病变分析利用透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）对养殖水体中Cu-NPs的特性进行了观察和分析。分析结果表明,Cu-NPs在养殖水体中产生了聚集。利用纳米颗粒追踪分析仪（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）测量养殖水体中Cu-NPs的粒径,发现其平均粒径为187±56 nm,明显大于初始的粒径分布（70±7.5 nm）。组织病变发现暴露于浓度为20μg/L Cu²⁺或Cu-NPs的暗纹东方鲀表现出鳃上皮细胞水肿,层状融合,鳃丝顶部棒状和粘液细胞肿胀。在暴露于浓度为100μg/L Cu²⁺或Cu-NPs的鳃组织,发现了更严重的病变,如鳃丝畸形,动脉瘤和坏死。所有未暴露于Cu²⁺或Cu-NPs的对照组中,鳃均展示出正常的组织学形态。在肝脏组织,暴露于20μg/L的Cu²⁺或Cu-NPs组的个体表现出水肿和静脉中血细胞沉积现象;而暴露于100μg/L的Cu²⁺或Cu-NPs的个体则表现出更为严重的病灶,如肝炎样损伤,坏死和细胞核固缩。对照组个体的肝脏均显示出正常的组织学形态。因此,Cu-NPs和Cu²⁺对暗纹东方鲀产生了毒性作用,并且在诱导暗纹东方鲀肝脏和鳃的组织病变的程度相类似。3.暗纹东方鲀肝脏中ERS介导的UPR信号通路及Ca²⁺稳态对水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露的响应通过qRT-PCR技术检测了暗纹东方鲀ERS标志基因（GRP78）、UPR信号通路关键基因（PERK、e IF2α、ATF-6α、IRE-1α和XBP-1）和Ca²⁺稳态调控基因（CRT）在水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露下的表达模式。结果显示,Cu-NPs（20μg/L及100μg/L）和Cu²⁺（20μg/L及100μg/L）暴露后,GRP78、CRT、PERK、e IF2α、ATF-6α、IRE-1α和XBP-1的m RNA表达量均发生了显著上调。在相同形式铜暴露下,上述七个基因在浓度为100μg/L处理组的表达量显著高于20μg/L处理组。此外,相同浓度下,这七个基因中的绝大部分基因（GRP78、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α和XBP-1）的m RNA表达在水体Cu-NPs和Cu²⁺处理组之间无显著性差异。利用蛋白质免疫印迹技术（Western Blot）检测暗纹东方鲀GRP78、p-PERK、ATF-6α、p-IRE-1α、CRT等蛋白在水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露下的响应。在蛋白质水平上,暴露于Cu-NPs（20μg/L及100μg/L）和Cu²⁺（20μg/L及100μg/L）后,GRP78、CRT、p-PERK、ATF-6α和p-IRE-1α表达相较于对照组均发生了显著上升。此外,这五个蛋白中的四个蛋白（GRP78、CRT、ATF-6α和p-IRE-1α）的表达在水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露之间无显著性差异。上述结果表明,水体Cu-NPs或Cu²⁺暴露可诱导暗纹东方鲀肝脏内发生ERS并激活了其介导的UPR及Ca²⁺信号通路。水体Cu-NPs和Cu²⁺暴露对暗纹东方鲀可能有着部分类似的毒性作用机制。