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第一部分C57BL/c小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和Notch信号检测目的：(1)体外分离培养C57BL/c小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs):(2)检测BMSCs上表达的Notch信号。方法：用密度梯度离心法和贴壁培养法分离培养BMSCs并扩增传代；流式细胞仪检测获得的第3代细胞表面标志抗原；定向诱导细胞成骨成脂分化及向内皮细胞分化；RT-PCR法和Western Blot法检测BMSCs上表达的Notch信号。结果：(1)原代培养的细胞24小时内可见呈梭形或星形的贴壁细胞,在2周内可扩增至106个数量级；第3代后的细胞呈较均一的梭状、成纤维状；传代后的细胞生长活跃,增殖能力强。(2)流式细胞检测显示细胞表达MSCs特异性表面抗原CD29和CD90,而内皮细胞表面抗原CD31和造血干细胞表面抗原CD34、CD45呈阴性。(3)成功诱导细胞分化为成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞。(4)RT-PCR法和Western Blot法检测到细胞上表达Notch通路中的Notch-1、Notch-2、 Notch-4、D11-1、D11-4、Jag-1、Hes-1和Hey-1分子。结论：用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合可获得纯度较高的BMSCs,传代后的细胞生长活跃,增殖能力强,具有多向分化潜能；BMSCs上表达Notch信号中的Notch-1、 Notch-2、Notch-4、D11-1、 D11-4、Jag-1、Hes-1和Hey-1分子。第二部分miR-1下调Dll-1—Hes-1/Notch信号调控BMSCs向心肌样细胞分化目的：(1)检测转染miR-1的BMSCs第1、7、14天Notch信号、Nkx2.5、GATA-4.cTnT和CX43表达情况。(2)检测沉默Dll-1的BMSCs第1、7、14天Notch下游效应分子、Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43变化。(3)检测沉默Hes-1的BMSCs第1、7、14天Nkx2.5、GATA-4、 cTnT和CX43表达情况。方法:(1)用pAJ-U6-shRNA-CMV-Puro/GFP载体,构建过表达miR-1慢病毒载体转染BMSCs,RT-qPCR法和Western Blot法检测过表达miR-1的BMSCs第1、7、14天Notch信号、Nkx2.5、GATA-4、 cTnT和CX43表达情况。(2)构建D11-1-shRNA慢病毒干扰载体转染BMSCs以沉默D11-1基因,RT-qPCR法和Western Blot法检测定向沉默Dll-1的BMSCs第1、7、14天Notch下游效应分子、Nkx2.5、GATA-4、 cTnT和CX43表达情况。(3)构建Hes-1-shRNA的慢病毒干扰载体转染BMSCs以沉默Hes-1基因,RT-qPCR法和Western Blot法检测定向沉默Hes-1的BMSCs第1、7、14天Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43的表达情况。结果：(1)转染miR-1的BMSCs在第7、14天Dll-1和Hes-1下调；转染miR-1的BMSCs在第7天有Nkx2.5和GATA-4表达,第14天时表达量下降；cTnT和CX43在转染miR-1的BMSCs第7天开始表达,第14天表达量增加。(2)定向沉默Dll-1的BMSCs在第7、14天Hes-1下调,Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43的表达情况与转染miR-1后的BMSCs效果相似。(3)定向沉默Hes-1的BMSCs第7、14天Nkx2.5、GATA-4、cTnT和CX43的表达情况与转染miR-1或定向沉默Dll-1的BMSCs相似。结论：miR-1可通过下调Dll-1,继而使下游效应分子Hes-1表达下降,调控BMSCs向心肌样细胞分化。第三部分验证miR-1靶向基因Dll-1目的：验证Dll-1是否miR-1的直接调节靶基因。方法：PCR扩增野生型DIM3’-UTR和突变型mutD11-13’-UTR基因序列,分别与双酶切PsiCHECKTM-2载体连接后转化DH5α感受态细胞,质粒酶切鉴定阳性克隆并测序；miR-1与质粒共转染293T细胞后收集裂解细胞液,用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测双荧光素酶活性判断Dll-1是否miR-1的靶基因。结果：在转染克隆有Dll-13’-UTR质粒的实验组中,检测荧光素酶活性显示miR-1组与空白组比较P<0.01;miR-1组与阴性对照组比较P<0.01,表明miR-1能与Dll-1的3’-UTR结合,从而抑制萤光素酶的活性；在转染克隆有mutD11-13’-UTR质粒的实验组中,miR-1组与空白组和阴性对照组比较差异均无统计学意义,表明miR-1不能与mutD11-13’-UTR结合而抑制萤光素酶的活性。结论：Dll-1是miR-1的靶基因。第四部分移植转染miR-1的BMSCs对小鼠心肌梗死区修复作用目的：探讨转染miR-1的BMSCs对小鼠心肌梗死区的修复作用。方法：结扎左前降支建立小鼠心肌梗死模型(假手术组10只),术前超声检测心功能。80只成功建立心肌梗死的小鼠随机分为PBS组、BMSCs组、转染空白载体的BMSCs组(BMSCsnull组)和转染miR-1的BMSCs组(BMSCsmiR-1组),每组20只,心梗后第7天分别以25ulPBS溶液或含相应细胞的溶液(1×106个细胞/m1),开胸直视下分6点注射入梗死区周边(5点)及中央区。移植4周后超声检测左心室功能,取出小鼠心脏标本并测定梗死面积及梗死区室壁厚度,免疫组织化学方法检测梗死区CX43、cTnT、α-SMA、Desmin和Vimentin的表达情况；采用激光共聚焦显微镜观察移植细胞存活及分化情况；Western-blot法检测梗死区Notch信号。结果：(1)在细胞移植4周后,超声检测显示各细胞移植组心功能明显优于PBS组(P<0.05或P<0.01),而移植BMSCsmiR-1组的心功能较移植BMSCs组或BMSCsnull组改善明显(均为P<0.05)；BMSCs组与BMSCs null比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)各细胞移植组与PBS组比较,梗死面积减小(P<0.05或P<0.01),而移植BMSCsmiR-1组的梗死面积较移植BMSCs组或BMSCsnull组缩小(均为P<0.05),而BMSCs组与BMSCs null组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)移植细胞组梗死区室壁厚度均较PBS组升高(P<0.05或P<0.01),而BMSCsmiR-1组较BMSCs组或BMSCsnull组室壁厚度增加(均为P<0.05),而BMSCsnull组梗死区室壁厚度与BMSCs组比较差异无统计学意义。(4)免疫组化和Western-blot示各细胞移植组与PBS组比较,梗死区CX43、cTnT、α-SMA、Desmin和Vimentin表达水平升高(P<0.05或P<0.01),其中BMSCs miR-1组均较其他细胞移植组表达增加(P<0.05)；而Western-blot示BMSCs miR-1组梗死区D11-1、Hes-1较其他组表达下降(P<0.05或P<0.01)。(5)激光共聚焦显示移植BMSCs miR-1组在梗死区的细胞存活率及向心肌细胞分化率较BMSCsnull组升高(P<0.05)。结论：(1)移植转染miR-1的BMSCs至梗死区可提高移植的BMSCs存活率及向心肌细胞分化率,减少心肌梗死面积,增加心室壁厚度,改善心功能；(2)体内实验也证实了miR-1能下调梗死区Dll-1、 Hes-1信号,进一步支持了体外细胞实验结论。