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过氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)形成了第一道抗氧化防御线,这道防御线共同发挥作用来抵御活性氧对机体造成的损伤。在鸡胚发育的过程中,这些酶从休眠态转化为激活态,为鸡胚的正常生长发育提供保障。在不同孵化阶段,不同组织器官内的活性也存在较大差异。本研究基于课题组前期筛选出的调控抗氧化酶活性的关键基因微粒体谷胱甘肽转移酶1(Microsomal glutathione transferase 1,MGST1),对目的基因进行RNA干扰,通过转录组测序技术鉴定干扰组(GR)和空白组(KB)的差异表达基因,以期找出MGST1调控抗氧化酶活性的分子机制。试验结果如下(1)鸡胚原代肝实质细胞培养条件的优化:选择将孵化至12 d-20 d的鸡胚蛋作为试验原材料,从鸡胚胚龄的选择、胰蛋白酶消化液的浓度及消化时间、胎牛血清类型及血清浓度、细胞生长因子等几个方面对原代培养鸡胚肝实质细胞的分离和培养条件进行摸索,最后选取鸡胚胚龄为16天、胰蛋白酶消化液浓度为0.25%并且含有EDTA、消化时间为12 min、选择进口胎牛血清,血清浓度为2%、培养液中添加细胞生长因子等条件作为培养鸡胚原代肝实质细胞优化后的条件。(2)鸡胚原代肝实质细胞转染试验:成功构建了MGST1的siRNA干扰片段,并利用lip2000转染试剂成功转染至体外培养的鸡胚原代肝实质细胞中。结果表明:转染效率达到70%以上,转染效率良好,能满足后续实验要求。同时,所构建的5个siRNA干扰片段均能在一定的程度上抑制鸡胚原代肝实质细胞中MGST1表达。其中,MGST1-gga-142干扰片段对鸡胚原代肝实质细胞中MGST1的抑制效率最高,达到了60.33%,干扰效果明显(P<0.01)。(3)转录组测序筛选差异表达基因:将干扰效率最高的MGST1-gga-142干扰后的鸡胚原代肝实质细胞作为干扰组(GR)与空白组(KB)进行转录组测序。测序共筛选出1064个差异表达基因,其中429个差异基因上调,635个差异基因下调。通过对筛选出的差异基因进行富集分析,发现7个关键基因,包括MGST2、NQO1、GPX2、GPX3、HAO1、APOA4和APOA1参与了MGST1对抗氧化酶活性的调控。确定MGST1是通过调控这7个差异基因来调控抗氧化酶活性,研究结果为后续明确抗氧化酶活性的代谢通路提供理论依据。