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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以认知功能进行性减退为特征的神经退行性疾病。记忆丧失、难以解释或理解事物以及个性和情绪的变化是AD最常见的临床症状。外泌体是一类直径约30～200 nm的细胞外囊泡,携带着m RNA、mi RNA和蛋白质等重要遗传信息,可以介导细胞间的信息传递和通讯。骨髓间充质干细胞来源的外泌体（exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC-exos）是可以执行骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）功能的细胞外囊泡。除了调控炎症免疫应答、胰岛素抵抗等生理病理过程外,BMSC-exos被证明可通过改善神经节细胞存活和神经胶质细胞损伤等多种途径发挥神经保护作用。本研究采用双侧侧脑室注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）的方法建立散发性AD（sporadic Alzheimer’s disease,SAD）小鼠模型,尾静脉或侧脑室注射给予BMSC-exos,通过经典的行为学方式观察对SAD小鼠神经精神行为的影响。在此基础上采用Western blot、定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,q PCR）、免疫荧光染色（immunofluorescence staining,IF）等方法检测各组小鼠海马组织中AD样神经病理学改变。以期揭示BMSC-exos对SAD的潜在治疗作用及可能机制,并为BMSC-exos的临床治疗作用开发提供实验依据。目的观察BMSC-exos对双侧侧脑室微量注射STZ诱导的SAD小鼠神经精神行为的影响,检测海马胶质细胞活化及炎症因子、淀粉样蛋白、微管相关蛋白和突触相关蛋白的表达变化,以探索BMSC-exos对SAD的保护作用及可能机制。方法1.建立SAD小鼠模型,观察小鼠神经精神行为变化,检测海马胶质细胞活化和炎症因子、淀粉样蛋白、微管相关蛋白以及突触相关蛋白的表达变化。16只雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组和SAD组。在立体定位仪引导下双侧侧脑室定向注射STZ药物溶液（3 mg/kg）建立SAD小鼠模型,对照组给予等量人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）。两周后进行旷场试验（open field test,OFT）、新物体识别实验（novel object recognition test,NOR）和悬尾实验（tail suspension test,TST）,观察神经精神行为变化。末次行为学结束后采集脑组织样本。免疫荧光染色法观察海马星形胶质细胞和小胶质细胞活化状态及突触相关蛋白的表达。Western blot方法检测海马组织淀粉样蛋白(β-amyloid 1-42,Aβ1-42)、淀粉样前体蛋白裂解酶（beta-site APP cleaving enzyme,BACE）、白介素1β（interleukin 1β,IL-1β）、白介素6（interleukin 6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、微管相关蛋白Tau5、磷酸化Tau蛋白（phosphorylated Tau protein,p-Tau）（Ser396）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、突触结合素1（synaptotagmin-1,Syt-1）、突触素1（synapsin-1,Syn-1）的蛋白表达水平。q PCR实验检测海马组织IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平。2.BMSC-exos对SAD小鼠神经精神损伤的保护作用及其机制研究从成年C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养的小鼠BMSCs上清液中提取BMSC-exos,经流式细胞仪分选纯化后体外培养。通过透射电子显微镜观察BMSC-exos形态,并通过Western blot实验检测外泌体的典型标记蛋白分化簇63（cluster of differentiation 63,CD63）、热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）、肿瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101 protein,TSG101）的表达。雄性C57BL/6小鼠24只,随机分为对照组、模型组、BMSC-exos侧脑室组（0.5μg/天）和BMSC-exos尾静脉注射组（25μg/天）。SAD建模6周后按照上述方法给予BMSC-exos,每日一次,连续5天,对照组和模型组小鼠给予等量的ACSF。采用OFT、高架十字迷宫（elevated plus maze,EPM）、NOR、Y迷宫（Y maze,Y-maze）和TST观察神经精神行为,q PCR技术检测海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平,Western blot法检测海马中Aβ1-42、BACE、GFAP、IBA1、p-Tau（Ser396）、Tau5、IL-1β、IL-6、TNF-α、BDNF、Syt-1和Syn-1的蛋白表达,免疫荧光染色检测海马GFAP、IBA1、Aβ、p-Tau和DCX的表达,硫黄素S染色观察海马中Aβ的表达。结果1.与对照组小鼠相比较,双侧侧脑室注射STZ模型组小鼠在OFT中央区域停留时间、跨线次数以及理毛次数等均显著减少,新物体偏好指数显著降低,而TST中不动时长没有统计学差异;IF结果显示模型组小鼠海马组织中星形胶质细胞活化显著增强,p-Tau表达量显著上升,Syt-1表达量显著降低;q PCR和Western blot结果表明,模型组小鼠海马中IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达量显著增加,淀粉样蛋白和其前体物剪切酶BACE以及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平显著上升,Tau蛋白磷酸化水平显著增加,突触相关蛋白BDNF、Syt-1、Syn-1等表达水平显著下降。2.侧脑室注射BMSC-exos可改善双侧侧脑室注射STZ诱导的SAD模型小鼠的神经精神行为异常,具体表现为提高其在旷场试验中的中央区域活动频率、时间及距离,提高其新物体偏好指数,而对新异臂偏好指数、EPM中封闭臂移动距离以及TST中不动时长没有显著影响;IF结果表明,侧脑室注射BMSC-exos可显著抑制SAD小鼠海马组织中的胶质细胞活化,促进神经新生,降低Aβ、p-Tau表达水平;q PCR和Western blot结果表明侧脑室注射BMSC-exos降低了IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA的表达水平,并降低Aβ、BACE、p-Tau、IL-1β、IL-6、TNF-α等蛋白表达水平,增加BDNF的蛋白表达量。结论1.双侧侧脑室注射STZ能够成功诱导SAD小鼠模型,具体表现为运动及探索行为减少、愉悦感降低及学习记忆功能障碍等AD样神经精神行为异常。同时表现出脑内炎症反应激活、淀粉样斑块积聚、Tau蛋白异常磷酸化以及突出可塑性损伤等神经病理学改变。2.侧脑室注射BMSC-exos能够改善SAD小鼠的神经精神行为异常,其作用机制可能与减轻神经炎症、降低Aβ和p-Tau的表达、调节突出可塑性相关蛋白BDNF的表达有关。