【摘 要】
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FTO参与mRNA上m~6A修饰的动态调控,依赖于Fe2+和2-OG来发挥去甲基化酶活性,影响细胞正常生理活动,与多种疾病尤其是肿瘤密切相关。抑制FTO对mRNA的调控成为目前热门的新型治疗手段之一,FTO抑制剂的研发成为近些年的热点。本研究针对FTO的作用条件,建立了一个酶水平的反应体系,以含有m~6A修饰的ss RNA为底物,加入FTO与抑制剂参与反应后,核酸酶P1与碱性磷酸酶水解RNA,HP
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FTO参与mRNA上m~6A修饰的动态调控,依赖于Fe2+和2-OG来发挥去甲基化酶活性,影响细胞正常生理活动,与多种疾病尤其是肿瘤密切相关。抑制FTO对mRNA的调控成为目前热门的新型治疗手段之一,FTO抑制剂的研发成为近些年的热点。本研究针对FTO的作用条件,建立了一个酶水平的反应体系,以含有m~6A修饰的ss RNA为底物,加入FTO与抑制剂参与反应后,核酸酶P1与碱性磷酸酶水解RNA,HPLC测定反应结束后体系内的m~6A含量。与不添加抑制剂,只有FTO发挥去甲基化作用后反应体系内m~6A含量结果进行比较、计算,量化抑制剂对F TO的抑制作用。通过已有报道的阳性药物验证反应体系的可行性,经过方法学验证表明,本研究建立的反应体系定量关系明确,专属性强,仪器精密度、方法重现性、稳定性均能满足检测定量所需。以m~6A含量为指标,LOD为5.0ng/m L（S/N＞3）,LOQ为10.0ng/m L（S/N＞10）,成功建立了体外基于HPLC定量的FTO促RNA去甲基化反应体系。在建立抑制剂活性筛选体系之后,我们以FTO-FB23复合物晶体结构开展了基于分子对接的虚拟筛选。根据虚拟筛选结果,从商业化合物库中购买99个化合物,利用前述抑制剂筛选体系,筛选发现1个化合物具有体外FTO抑制活性,IC50值为3.15μM。为进一步开发高活性FTO抑制剂提供了先导化合物。综上,本文成功建立了酶水平的FTO抑制剂筛选体系,利用这一筛选体系对虚拟筛选获得的99个化合物进行筛选,成功发现一个微摩尔级别抑制剂分子,为开发靶向FTO药物打下了良好的实验室基础。
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