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以马尾松(Pinus massoniana Lamb.)优良种源广西桐棉成熟种子为起始材料,以无菌实生苗顶芽为外植体,进行不定芽诱导、伸长、增殖和不定根诱导及其发生的解剖学观察并进行了炼苗和移栽等试验,对马尾松组织培养进行了系统研究,初步建立了马尾松快速繁殖体系,研究结果表明:
1.低浓度的GA对马尾松种子发芽表现出抑制作用,当GA浓度达到100mg/L时催芽效果明显好于对照,本试验最好的催芽方式为:GA(100mg/L)开盖催芽24h。
2.马尾松种子消毒试验试验中最佳的灭菌组合为15(75%酒精3min+0.1%HgCl215min+3%NaClO25min)发芽率最高为23.22%,方法12(75%酒精3min+0.1%HgCl220min+3%NaClO20min)次之,方法1最差,其发芽率仅为2.67%,适当的延长0.1%HgCl2的灭菌时间可以提高灭菌率,但对种胚产生伤害。种子灭菌不宜用高浓度的HgCl2作为灭菌剂。
3.不同苗龄的实生苗顶芽消毒的难易程度不同,苗龄大消毒难度大,污染率高,苗龄小对消毒剂比较敏感,消毒剂的毒害作用比较明显,死亡率比较高。苗龄为9d的顶芽灭菌效果最好,污染率仅有3.3%,其成活率也最高,为93.3%;消毒剂的消毒时间对外植体的消毒效果有明显的影响,随着消毒时间的延长,污染率降低,褐化死亡率升高,组合为75%酒精10s+0.1%HgCl28min时,马尾松实生苗顶芽的灭菌效果最好,灭菌率最高,为96.3%,成活率为92.6%。
4.不同苗龄、6-BA、NAA浓度对初次芽诱导的影响试验结果表明:不同苗龄对马尾松不定芽的初次诱导率和增殖系数有显著的影响,80d苗龄接种于附加2mg/L6-BA以及0mg/LNAA的DCR培养基中生长7周后子叶基部大部分诱导出不定芽;6-BA对提高不定芽的初次诱导率作用也很明显,但对增殖系数的提高作用不很明显;NAA对不定芽的初次诱导率和增殖率的提高作用不明显,所设置的浓度梯度对诱导率和增殖率作用差异不显著。本试验中诱导率和增殖系数最高的最佳组合为16(苗龄80 d+6-BA2.0 mg/L+NAA0mg/L)诱导率达到87.23%,增殖系数最高为3.26。
5.在马尾松不定芽伸长试验中蔗糖和活性炭对伸长有明显的促进作用,生长激素对其伸长促进作用不很明显。组合7(活性炭0.1%+蔗糖30g/L+NAA0.3mg/L)最有利于马尾松不定芽的伸长,伸长率达到126.6%,其次为组合8(活性炭0.2%+蔗糖40g/L+NAA0.2 mg/L)伸长率达到117.3%。
6.在多次继代后不定芽的增殖试验中,NAA对诱导率的作用随浓度的递增呈现出先增后降的趋势,适当低浓度的NAA对不定芽的增殖率的提高有一定的促进作用,而高浓度(0.05mg/L)时增殖率明显降低,对增殖率起抑制作用,以0.03 mg/L最好,增殖率随6-BA浓度的提高而提高,因此高浓度的6-BA对增殖率提高有促进作用;组合8(6-BA2.0mg/L+NAA0.03mg/L)和组合9(6-BA2.5mg/L+NAA0.03mg/L)增殖率最高到达100%;组合4(6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L)增殖系数最高到达5.03。
7.在马尾松不定根诱导试验中,培养基是影响生根效应的主要因子,NAA的加入有利于根的伸长和须根的产生;IBA的加入有利于大量根的产生和根的增粗,但须根较少,且浓度大于2.0 mg/L时产生大量愈伤组织,延迟了生根时间,最适生根培养基组合是1/3DCR+NAA0.15 mg/L+蔗糖20%+琼脂0.6%,两个月最高生根率达到51.7%,须根多,根系质量高;经过伸长生长的多次继代增殖芽的生根率明显高于其它苗源,25d生根率即可达到33.33%,45d生根率达到75%,且不定根数目多,根系健壮。同时对马尾松组培苗发育过程进行了解剖学观察,结果表明马尾松组培苗嫩茎无潜伏根原基,不定根由诱生根原基发育形成,诱导根原基源于髓射线细胞的分化。
8.炼苗试验中:(1)在T3(闭盖21d)+t2(开盖2d)处理下,组培苗生长状态良好,移栽成活率最高,均值达到78.89%,随着闭盖炼苗时间的增加成活率呈上升趋势,但随着开瓶炼苗时间的增加,成活率呈先增后降趋势;(2)不同基质组成及配比对试管苗的成活率具有显著的影响,最佳组合为A3(0.1%多菌灵浸泡30min)+B3(黄心土:河沙:珍珠岩=3:2:2),成活率达到88.65%;(3)根条数多利于移栽成活,根长度大于4cm和小于2cm不利于移栽成活。
9.根诱导培养天数对马尾松组培苗移栽的成活率有显著影响。根诱导培养80d的组培苗,移栽成活率在80%以上;开盖炼苗后罐头瓶中加入无菌水和0.05%多菌灵比不加任何物质的对照可以明显减少炼苗阶段的污染;炼苗中污染的生根苗经过多菌灵和酒精消毒后移栽成活率明显高于对照,最佳消毒效果组合为0.1%多菌灵30min+75%酒精20s,成活率到达90%。
综上所述,通过马尾松组织培养试验,已经建立了马尾松快速繁殖体系,以不同途径获得的马尾松无菌芽为外植体实现了不定根的诱导和炼苗移栽的成功,为马尾松组培苗大规模的工厂化生产提供了可靠的理论依据。