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哮喘是以可逆性气道阻塞,气道高反应性,粘液分泌增加,气道重塑以及上皮基底膜下胶原沉积为特征的慢性炎症性气道疾病。粘液过度分泌导致气道阻塞以及感染加重是哮喘发作面临的重要问题。虽然近年来哮喘规范治疗在我国得到了广泛推广,但对于哮喘气道粘液高分泌并无特异的有效的药物治疗方法,寻找治疗哮喘气道粘液高分泌新靶点是值得深入探索的问题。气道上皮黏附分子在维持气道上皮结构完整、稳态和炎症反应中发挥重要作用,黏附分子异常表达破坏气道上皮完整性并诱导肺部炎症反应,参与哮喘的发生发展。CTNNAL1（catenin alpha-like 1）是一种与α-连环蛋白（α-catenin）高度同源的黏附分子。本课题组前期研究发现CTNNAL1在哮喘患者人支气管粘膜上皮及卵清蛋白诱导的哮喘小鼠模型支气管肺组织中表达下调且与气道反应性增加相关,但是关于CTNNAL1与哮喘粘液高分泌之间的关系及其作用机制尚未完全阐明。目的:1.明确CTNNAL1对HDM诱导的哮喘小鼠气道粘液分泌的影响;2.探讨CTNNAL1调节气道粘液分泌的作用机制。方法与结果:1.CTNNAL1对HDM诱导的哮喘小鼠气道粘液分泌的影响方法:使用腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）为载体,引入CTNNAL1 si RNA序列,构建支气管肺组织CTNNAL1低表达的小鼠模型;将CTNNAL1沉默质粒和高表达质粒分别转染至人支气管上皮细胞系16HBE14o-构建CTNNAL1基因沉默细胞模型和CTNNAL1高表达细胞模型;实时荧光定量核酸扩增（RT-q PCR）、免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹（WB）法检测CTNNAL1表达水平,确证CTNNAL1低表达小鼠和CTNNAL1沉默或高表达细胞模型构建成功。以屋尘螨（house dust mite,HDM）变应原应激构建哮喘小鼠模型和人支气管上皮细胞应激损伤模型。（1）动物分组:对照病毒组（AAV5-CON305）、CTNNAL1沉默组（AAV5-CTNNAL1-RNAi）、对照病毒+HDM组（AAV5-CON305+HDM）、CTNNAL1沉默+HDM组（AAV5-CTNNAL1-RNAi+HDM）;（2）低表达细胞分组:对照质粒组（p FU-GW-007）、CTNNAL1沉默组（CTNNAL1-si RNA）、对照质粒+HDM组（p FU-GW-007+HDM）、CTNNAL1沉默+HDM（CTNNAL1-si RNA+HDM）组;（3）高表达细胞分组:对照质粒组（pc DNA3.1）、CTNNAL1高表达组（CTNNAL1）、对照质粒+HDM组（pc DNA3.1+HDM）、CTNNAL1高表达+HDM组（CTNNAL1+HDM）。苏木素-伊红（H＆E）染色法检测肺组织病理学变化,Masson染色法检测肺组织胶原纤维沉积情况,取小鼠肺泡灌洗液（BALF）后细胞涂片,瑞氏吉姆萨染色,然后细胞分类计数。RT-q PCR和酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠BALF中炎症因子IL-13和IL-4的分泌情况。扫描电镜观察小鼠气道粘液分泌情况、纤毛数量以及形态,过碘酸雪夫（PAS）染色法观察粘液在肺组织分布情况。应用RT-q PCR法检测小鼠肺组织中纤毛相关动力蛋白（dynein heavy chain 5,DNAH5）、DNAH9、粘蛋白5AC（mucin5AC,MUC5AC）,粘蛋白5B（mucin5B,MUC5B）,囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）和水通道蛋白（Aquaporin,AQP）的表达水平。WB和免疫组化检测小鼠肺组织中MUC5AC、CFTR和AQP5的表达水平。WB和RT-q PCR检测人支气管上皮细胞系16HBE14o-中MUC5AC、CFTR和AQP5的表达,免疫荧光检测人支气管上皮细胞系16HBE14o-中CFTR的表达。结果:AAV5-CTNNAL1-RNAi可对小鼠支气管肺组织CTNNAL1的表达进行有效的抑制;转染CTNNAL1沉默质粒的16HBE14o-细胞中CTNNAL1表达显著下调,提示CTNNAL1低表达的小鼠和细胞模型构建成功;转染CTNNAL1高表达质粒的16HBE14o-细胞中CTNNAL1表达显著增加,提示CTNNAL1高表达的细胞模型构建成功。CTNNAL1低表达和HDM刺激均可以使得小鼠肺组织炎症浸润和胶原沉积增加,HDM应激后的CTNNAL1低表达小鼠肺组织炎症浸润和胶原沉积显著增加。肺组织低表达CTNNAL1的小鼠BALF中总细胞数增加,淋巴细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞数量增加,BALF中IL-4和IL-13的分泌明显增加,受到HDM应激后,总细胞数和各类细胞数以及炎性细胞因子分泌明显增加。扫描电镜观察小鼠气道粘液分泌情况,结果显示CTNNAL1低表达小鼠气管内粘液分泌明显增加,纤毛粘连倒伏。PAS染色结果显示,在HDM刺激下,CTNNAL1低表达小鼠肺组织杯状细胞增生和粘液分泌明显增加。CTNNAL1低表达并不会改变小鼠肺组织中DNAH5、DNAH9和粘蛋白MUC5B的表达,但是,在HDM应激下,CTNNAL1低表达小鼠肺组织中MUC5AC表达明显增加,CFTR和AQP5表达明显下降。在HDM应激下,CTNNAL1沉默的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达显著增加,CFTR和AQP5显著下降。2.CTNNAL1对ROCK1和ROCK2表达的影响方法:本课题组前期研究表明CTNNAL1通过影响Rho/ROCK信号通路进而影响上皮细胞骨架动态分布和黏附分子的表达水平。为了探讨CTNNAL1对HDM应激诱导的哮喘小鼠粘液分泌影响的机制,RT-q PCR和WB检测CTNNAL1低表达肺组织中和人支气管上皮细胞系16HBE14o-中Rho相关螺旋激酶1（Rho associated coiled-coil kinase 1,ROCK1）和Rho相关螺旋激酶2（ROCK2）的表达。应用ROCK2抑制剂KD025处理CTNNAL1沉默的人支气管上皮细胞,RT-q PCR和WB检测MUC5AC和CFTR的表达,RT-q PCR和ELISA检测细胞及培养上清中细胞因子IL-13和IL-4的表达和分泌水平。取AAV5-CON305组和AAV5-CTNNAL1-RNAi组小鼠气管做离体培养,应用ROCK2抑制剂KD025处理离体培养的小鼠气管,RT-q PCR和WB检测MUC5AC和ROCK2的表达,RT-q PCR和ELISA检测小鼠气管组织和培养上清中细胞因子IL-13和IL-4表达和分泌水平。应用ROCK1小干扰RNA或ROCK1抑制剂Y27632处理CTNNAL1沉默的人支气管上皮细胞,RT-q PCR和WB检测MUC5AC和CFTR的表达。同时,应用ROCK1小干扰RNA处理CTNNAL1高表达的细胞,RT-q PCR和WB检测CFTR的表达。应用Rho A激动剂CN03处理CTNNAL1低表达的小鼠气管和细胞,RT-q PCR和WB检测CFTR和ROCK1的表达。结果:CTNNAL1低表达小鼠肺组织中ROCK1的表达下降,ROCK2的表达上调;在HDM刺激后,ROCK1表达进一步下降,而ROCK2的表达水平显著增加。体外实验结果与体内实验结果一致。在CTNNAL1基因沉默的人支气管上皮细胞系16HBE14o-和体外培养小鼠气管中抑制ROCK2后,MUC5AC、ROCK2、IL-13和IL-4表达明显下降,但是CFTR表达没有改变。在CTNNAL1基因沉默的人支气管上皮细胞中抑制ROCK1后,MUC5AC的表达并没有明显改变,但是CFTR表达显著减少。同时,CTNNAL1高表达的16HBE14o-细胞中CFTR表达增加,抑制ROCK1后,CFTR表达减少。在CTNNAL1基因沉默的16HBE14o-细胞中应用Rho A激动剂CN03后,ROCK1和CFTR表达水平明显增加,同时,在体外培养的小鼠气管中应用Rho A激动剂CN03后也观察到一致的结果。3.CTNNAL1调节MUC5AC分泌的机制研究方法:研究表明Yes相关蛋白（Yes associated protein,YAP）与CTNNAL1高度同源分子α-catenin能直接相互作用并且YAP与ROCK2启动子结合促进ROCK2的表达,猜测YAP可能参与CTNNAL1调控ROCK2过程。在体外实验中,RT-q PCR和WB检测CTNNAL1高表达或者沉默时YAP的表达情况。免疫共沉淀技术确证CTNNAL1与YAP的相互作用。应用YAP小干扰RNA处理细胞,RT-q PCR和WB检测YAP、ROCK1和ROCK2的表达。同时用YAP和CTNNAL1小干扰RNA处理细胞,RT-q PCR和WB检测ROCK1和ROCK2的表达,RT-q PCR和ELISA检测细胞及培养上清MUC5AC、IL-13和IL-4的表达和分泌。结果:CTNNAL1沉默时,YAP表达增加。反之,CTNNAL1高表达时,YAP表达降低。免疫共沉淀实验证明CTNNAL1与YAP存在相互作用。应用YAP小干扰RNA处理细胞后,ROCK2表达下降,ROCK1表达没有改变。应用si RNA干扰YAP的表达可逆转CTNNAL1沉默对人支气管上皮细胞ROCK2、MUC5AC、IL-4和IL-13表达的上调,提示CTNNAL1可通过YAP信号通路降低粘蛋白MUC5AC和细胞因子IL-13,IL-4的表达;同时我们也发现沉默YAP对ROCK1的表达没有影响,提示ROCK1可能不受YAP表达调控。4.CTNNAL1调节CFTR表达的机制研究方法:文献报道,CFTR相关配体（CFTR-associated ligand,CAL）通过靶向CFTR在溶酶体中降解从而下调CFTR的表达,而Rho家族成员TC10可以通过与CAL相互作用提高CFTR的表达。由此推测CTNNAL1可能通过Rho/ROCK与CAL的相互作用调节CFTR的表达。在体外实验中,RT-q PCR和WB检测CTNNAL1沉默时CAL的表达水平。应用CAL小干扰RNA处理CTNNAL1沉默的细胞后,RT-q PCR和WB检测ROCK1和CFTR表达情况。免疫共沉淀技术确证ROCK1与CAL具有相互作用。结果:CTNNAL1沉默的人支气管上皮细胞中CAL表达增加,受到HDM应激后,CAL表达进一步增加。应用CAL小干扰RNA处理CTNNAL1沉默的细胞后,ROCK1表达并没有明显改变,CFTR表达明显增加。免疫共沉淀技术确证ROCK1与CAL具有相互作用。结论:1.CTNNAL1低表达促进HDM诱导的粘液分泌增加。2.CTNNAL1通过YAP-ROCK2信号通路下调粘蛋白MUC5AC的表达。3.CTNNAL1通过ROCK1-CAL信号通路促进CFTR的表达。图49幅,表15个,参考文献120篇