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研究背景与目的:脓毒症（sepsis）是宿主遭受感染时所产生的失控的、持久的炎症反应,从而出现免疫失调和多器官功能损害,病情危重,预后极差。目前普遍认为炎症反应及炎性细胞因子分泌紊乱在脓毒症发生发展中扮演重要角色。巨噬细胞（macrophages,Mψ）是机体非特异性免疫重要组成细胞,特别是在炎性细胞因子分泌中发挥主要作用。促炎介质刺激下巨噬细胞可分泌一系列炎症介质如一氧化氮（Nitric Oxide,NO）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）以及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等。NO不仅是重要的神经递质,可介导神经信息的传递、调节血管舒缩功能以及减少血栓形成,还是介导免疫过程和炎症反应的重要炎性介质。NO在炎症反应中的作用犹如一把“双刃剑”,一方面,NO的大量释放有助于抵御病原体的入侵;但另一方面,NO浓度过度升高可能会产生细胞毒性效应,因此,精细调控NO的生成在炎症反应中至关重要,但目前,调控NO生成的分子机制,研究尚不明确。中性粒细胞颗粒蛋白（Neutrophilic granule protein,NGP）属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族,已有研究证实半胱氨酸蛋白酶抑制剂可通过调控细胞因子产生广泛参与炎症过程的多个环节。课题组前期工作发现,给予脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导建立炎症模型,NGP可促进巨噬细胞分泌抑炎因子白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）,并抑制促炎因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和TNF-α的表达,NGP在巨噬细胞参与的炎症反应过程中发挥重要作用。同时,我们还发现NGP与巨噬细胞NO的生成密切相关,但NGP调控NO生成的作用和分子机制,尚不清楚。因此,本研究拟以NGP高表达和NGP敲除的巨噬细胞株和转基因小鼠原代腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages,PMs）为研究对象,构建LPS刺激模型,明确NGP对巨噬细胞生成NO的影响及其调控的分子机制。实验方法:一、NGP对LPS诱导的巨噬细胞生成NO的影响。1.体外培养NGP高表达RAW264.7细胞（NGP/RAW）和阴性对照空载体RAW264.7细胞（NC/RAW）,NGP敲除RAW264.7细胞（NGP KO/RAW）和阴性对照野生型RAW264.7细胞（WT/RAW）,建立LPS炎症模型。使用Western blot检测细胞中NGP和i NOS蛋白表达情况。使用Griess方法和q RT-PCR检测细胞中NO和i NOS m RNA表达情况。2.提取NGP高表达小鼠和C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞（PMs）并体外培养,建立LPS体外刺激模型,使用Western blot检测细胞中NGP蛋白表达情况,用Griess方法和q RT-PCR检测细胞NO和i NOS m RNA的表达情况。二、NGP通过STAT1/i NOS通路正向调控活化巨噬细胞的NO的生成。1.体外培养NGP/RAW和NC/RAW,建立LPS刺激模型,使用Western blot检测细胞中磷酸化STAT1（p-STAT1）蛋白表达情况。2.提取NGP高表达小鼠和C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞（PMs）并体外培养,建立LPS体外刺激模型,使用Western blot检测细胞中p-STAT1蛋白表达情况。3.体外培养NGP/RAW和NC/RAW,使用抑制剂氟达拉滨（Fludarabine）预先处理细胞,再用LPS刺激,采用Griess方法和q RT-PCR检测细胞中上清中NO和i NOS m RNA表达情况。实验结果:一、NGP上调LPS诱导的巨噬细胞NO的生成。1.与NC/RAW细胞相比,NGP/RAW细胞中NGP蛋白表达明显较高。给予LPS诱导后,NGP/RAW细胞内i NOS m RNA和NO表达较NC/RAW细胞明显增加。2.与WT/RAW细胞相比,NGP KO/RAW细胞中NGP不表达。给予LPS诱导后,NGP KO/RAW细胞内i NOS m RNA和NO表达较WT/RAW细胞明显减少。3.在原代腹腔巨噬细胞中,与C57BL/6小鼠相比,NGP高表达小鼠原代PMs中NGP蛋白表达水平较高。给予LPS诱导后,NGP高表达小鼠原代PMs中i NOS m RNA和NO表达量较C57BL/6小鼠原代PMs明显增加。二、NGP通过STAT1/i NOS通路正向调控LPS诱导的巨噬细胞NO的生成。1.在RAW264.7细胞株中,给予LPS诱导后,NGP/RAW细胞内p-STAT1蛋白表达较NC/RAW细胞明显增加。2.在原代PMs中,给予LPS诱导后,NGP高表达小鼠原代PMs中p-STAT1蛋白表达较C57BL/6小鼠原代PMs明显增加。3.在RAW264.7细胞株中,抑制STAT1磷酸化后,NGP/RAW细胞内NO生成量和i NOS表达量出现明显下降,但是在NC/RAW细胞中无明显变化。结论:1.高表达NGP增加LPS诱导的巨噬细胞NO生成,敲除NGP降低NO生成,提示NGP可正向调控LPS诱导的巨噬细胞生成NO水平。2.LPS诱导巨噬细胞活化,NGP可上调STAT1通路磷酸化水平,从而增加i NOS和NO的表达,提示NGP通过STAT1/i NOS通路正向调控LPS诱导的巨噬细胞NO生成。