人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是传统名贵中药材,抗肿瘤是其主要活性之一。人参皂苷(ginsenoside)是主要抗肿瘤活性成分,分为原人参二醇(Protopanaxadiol,PPD)型、原人参三醇(Protopanaxatriol,PPT)型和齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)型。人参的应用多为混合人参皂苷的应用,以前的研究工作发现多种人参皂苷(如人参皂苷Re,Rg1和Ro)对肿瘤细胞或者血管内皮细胞的生长有促进作用,传统观点认为肿瘤病人不能服用人参,需要服用次级人参皂苷(Rg3,Rh2等)。因此,对人参皂苷抗肿瘤活性研究有助于理解人参整体的疗效,指导人参在抗肿瘤中的临床应用。本研究分为四个部分:第一部分:生晒参、冻干参和红参对肿瘤转移影响。生晒参、冻干参和红参分别由同一年生、同一品种的人参炮制而成。利用实验性肺转移模型考察三种不同炮制方式的人参对肿瘤转移影响。尾静脉注射B16F10黑色素高转移瘤细胞至C57BL/6J小鼠体内,实验分为6组:空白对照组(未接种肿瘤细胞)、模型对照组、阳性药物对照组、生晒参给药组、冻干参给药组、红参给药组。空白与模型对照小鼠灌胃给药生理盐水,阳性对照小鼠腹腔注射环磷酰胺(20 mg/kg),生晒参、冻干参和红参给药组分别灌胃剂量为900 mg/kg药材粉末。连续给药2周后,解剖观察并计数小鼠肺转移灶数,计算肿瘤转移抑制率。体内实验及病理切片结果显示,生晒参、冻干参和红参均具有体内抗B16F10细胞肿瘤转移活性,肿瘤转移抑制率分别为68.67%、66.08%和35.42%。HPLC法测定生晒参、冻干参和红参中人参皂苷含量,三者中主要人参皂苷为Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Ro等。生晒参、冻干参、红参溶出度测定结果表明,三者中红参的皂苷溶出度最低。第二部分:PPD型人参皂苷对肿瘤及血管生成影响。以PPD型人参皂苷Rb1、(S)-Rg3、(R)-Rg3、Rg5、CK、PPD为受试药,分别进行B16F10、HUVEC细胞毒实验,tube formation实验、transwell实验,以及鸡胚尿囊膜(CAM,chick embnyo chorioallantoic menbreme)血管生成实验,考察PPD型人参皂苷对肿瘤细胞生长和血管新生影响。以Rb1、(S)-Rg3为受试药,利用移植性肿瘤动物模型、肿瘤血管生成模型研究受试药对小鼠肿瘤生长及血管生成影响。结果显示,低浓度人参皂苷Rb1(1-30μg/m L)和(R)-Rg3(1-30μg/m L)对B16F10细胞生长无显著影响,高浓度(100μg/m L)时具有弱细胞毒活性,而Rb1(1-100μg/m L)和(R)-Rg3(1-100μg/m L)对HUVEC细胞生长无显著影响;Rg5、(S)-Rg3、CK及PPD对B16F10和HUVEC细胞具有强细胞毒活性,对B16F10细胞的IC50值分别为12.89、8.48、7.51和5.35μg/m L;对HUVEC细胞的IC50值分别为13.90、19.68、8.36和11.61μg/m L。Tube formation实验结果显示,人参皂苷Rb1(100μg/m L),(S)-Rg3(30μg/m L),Rg5(25μg/m L)对HUVEC细胞小管形成抑制率分别为9.04、71.12、34.17%。人参皂苷(R)-Rg3(100μg/m L)和PPD(25μg/m L)对HUVEC形成小管无显著抑制作用。人参皂苷CK抑制HUVEC细胞小管形成作用最强,给药浓度为15μg/m L时,无小管形成。细胞迁移和侵袭实验结果表明,Rb1(1-30μg/m L)、CK(1.25-15μg/m L)、PPD(5-25μg/m L)对HUVEC细胞迁移和侵袭能力无显著影响,Rb1(100μg/m L)对HUVEC细胞迁移促进率为5.7%,侵袭促进率为6.1%(p>0.05);人参皂苷(S)-Rg3和Rg5抑制HUVEC细胞迁移和侵袭,且呈剂量依赖性。(S)-Rg3给药浓度分别为20、25和30μg/m L时,对HUVEC细胞迁移抑制率分别为23.3、27.8和37.8%,细胞侵袭抑制率分别为22.0、18.3和26.8%。人参皂苷Rg5给药浓度为15、20和25μg/m L时,对HUVEC细胞迁移抑制率分别为17.6、20.6和40.2%,细胞侵袭抑制率分别为25.5、29.6和51.0%。CAM实验结果显示,人参皂苷Rb1显著促进一级血管和二级血管生成(p<0.05),人参皂苷(S)-Rg3、(R)-Rg3、Rg5、CK显著抑制一级血管和二级血管生成(p<0.05),PPD抑制CAM三级血管生成(p>0.05)。小鼠体内实验结果显示,腹腔注射人参皂苷Rb1(30 mg/kg)的荷瘤鼠肿瘤体积增殖率为14.2%,血管生成增长率为53.3%(p<0.05);腹腔注射(S)-Rg3(30 mg/kg)对肿瘤生长和血管生成的抑制率分别为75.3%(p<0.01)和34.2%(p<0.01)。二者均对荷瘤小鼠具有免疫增强作用。第三部分:PPT型人参皂苷对肿瘤及血管生成影响。方法与第二部分实验方法相同,以人参皂苷Re、Rg1、(S)-Rh1、(R)-Rh1、PPT为受试药,考察PPT型人参皂苷对肿瘤细胞生长和血管新生影响及人参皂苷Re、Rg1对小鼠肿瘤生长及血管生成影响。结果显示,人参皂苷Re(1-100μg/m L)和Rg1(1-100μg/m L)对B16F10和HUVEC细胞生长无显著影响;(S)-Rh1(100μg/m L)和(R)-Rh1(100μg/m L)对B16F10细胞活性抑制率分别为10.42%(p>0.05)和21.59%(p<0.01),(S)-Rh1(100μg/ml)显著促进HUVEC细胞增殖,增殖率为72.4%(p<0.01),(R)-Rh1(1-100μg/m L)对HUVEC细胞生长无显著影响;PPT(5-25μg/m L)对B16F10细胞毒活性呈剂量依赖性,其IC50值为14.8μg/m L,PPT(80μg/ml)对HUVEC活性抑制率为42.4%(p<0.01)。PPT(80μg/m L)对HUVEC细胞小管生成抑制率为44.97%,Re(1-100μg/m L)、Rg1(1-100μg/m L)、(S)-Rh1(1-100μg/m L)、(R)-Rh1(1-100μg/m L)对HUVEC细胞小管形成无显著影响。人参皂苷Re(100μg/m L)和Rg1(100μg/m L)促进HUVEC细胞增殖(p>0.05)。(S)-Rh1(100μg/m L)抑制HUVEC细胞迁移和侵袭活性较弱(p>0.05);(R)-Rh1对HUVEC细胞迁移无显著影响,对HUVEC细胞侵袭抑制率为5.0%(p>0.05);PPT高浓度(80μg/m L)抑制HUVEC细胞迁移和侵袭,抑制率分别为5.89(p>0.05)和9.11%(p>0.05)。Rg1、(S)-Rh1、(R)-Rh1显著促进CAM一级血管生成,对二级血管有不同程度的促进作用,PPT对CAM血管生成无显著影响。体内实验结果显示,腹腔注射人参皂苷Re(30 mg/kg)促进荷瘤鼠肿瘤生长,荷瘤鼠肿瘤体积为模型小鼠的1.49倍,肿瘤血管生成增殖率为57.7%(p<0.01)。腹腔注射人参皂苷Rg1(30 mg/kg),荷瘤鼠肿瘤体积抑制率为13.8%,瘤血管生成增殖率为18.1%(p>0.05)。Rg1和Re对荷瘤小鼠具有免疫增强活性。第四部分:齐墩果酸型皂苷对肿瘤及血管生成影响及其小鼠体内协同抗肿瘤作用。以齐墩果酸型皂苷Ro及zingibroside R1(R1)、chikusetsusaponin Iva(IVa)、calendulaoside E(E)、songoroside A(S-A)、oleanolic acid(OA)、oleanonic acid(oxo-OA)作为受试药,考察齐墩果酸型皂苷体内外抗肿瘤活性及体外对血管生成影响,以溶血实验考查齐墩果酸型皂苷细胞毒作用是否由于胆固醇积累引起细胞膜受损。结果显示,体外Ro和Iva低浓度(1.0-30μg/m L)对B16F10细胞活性无显著影响,高浓度(100μg/m L)时细胞活性抑制率分别为5%和13%;但Iva和Ro促进HUVEC细胞增殖;OA对B16F10细胞毒活性呈剂量依赖性,1和100μg/m L浓度OA对B16F10细胞活性抑制率分别为10%和39%;此外,OA在给药浓度为100μg/m L时,HUVEC细胞活性抑制率为28%。R1、S-A、oxo-OA、E显著抑制B16F10和HUVEC细胞活性,其IC50值分别为25.8、8.5、3.1和2.2μg/m L(B16F10)和24.0、2.7、15.0、6.8μg/m L(HUVEC)。Tube formation实验结果显示,Ro(100μg/m L)、Iva(100μg/m L)、OA(100μg/m L)、R1(40μg/m L)、oxo-OA(30μg/m L)的HUVEC细胞小管生成长度百分比分别为117.0、72.0、53.0、39.0、34.2%,S-A和E显著抑制HUVEC细胞小管生成,分别在给药浓度为12和10μg/m L时,无小管生成。溶血实验结果显示,R1浓度为20和30μg/m L时,溶血率分别为2.99和83.11%,E在4μg/m L全部溶血,其他OA型皂苷未发生溶血反应。结果显示,OA型人参皂苷均具有小鼠体内抗肿瘤活性,腹腔注射E(5 mg/kg)和OA(25 mg/kg)肿瘤抑制率相近,分别为85.4和84.9%,Iva(25 mg/kg)、oxo-OA(25 mg/kg)、Ro(25 mg/kg)肿瘤抑制率相近,约为75%,SA(25 mg/kg)和R1(25 mg/kg)体内抗肿瘤活性较弱。本研究结论如下:本文澄清了“肿瘤病人不能服用人参,需要服用次级人参皂苷”的传统观点,证明人参整体应用具有抗肿瘤疗效。探讨了代表性人参皂苷对肿瘤及其血管生成的影响。得出以下结论:1.生晒参、冻干参和红参均对B16F10黑色素瘤肺转移模型小鼠具有肿瘤转移抑制作用。2.同一年生、同一品种、不同炮制方式的人参抗肿瘤转移活性存在差异:生晒参和冻干参抗肿瘤转移活性较强,二者无显著差异,红参效果最弱。3.人参皂苷(S)-Rg3、Rg5、CK及PPD具有抗肿瘤及血管生成活性。4.(S)-Rg3抗肿瘤及抑制血管生成活性较(R)-Rg3强。5.在体外,OA型人参皂苷对B16F10细胞作用规律是:C-3位连接糖基团,C-28位连接羧基,对B16F10细胞毒活性比C-3和C-28位同时连接糖基团的皂苷强;OA型人参皂苷对HUVEC细胞作用规律是:C-3位和C-28位同时连接糖基团显著促进HUVEC细胞增殖;C-3位连接糖基团,C-28位连接羧基的皂苷对HUVEC细胞具有细胞毒活性。6.OA型皂苷小鼠体内抗肿瘤活性不遵循体外试验构效关系。人参皂苷Ro抗肿瘤效果实际是Ro及其代谢产物发挥协同作用结果。