钙离子通道促进剂及抑制剂对香蕉抗寒性的影响及相关基因MaCNGC家族成员鉴定与表达分析

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香蕉(Musa spp.),原产地位于亚洲东南部的热带地区,是重要的果粮兼用作物,对温度要求较高,属于对低温敏感的植物。在种植香蕉的北部边缘地区,气温骤降和冬春寒潮侵袭造成的危害是制约香蕉产业发展的主要障碍之一。因此,开展与香蕉抗寒能力相关的科学研究,培育性状优良的抗低温品种,对香蕉的育种和生产具有极大的意义。本研究以‘巴西蕉’为实验材料,探讨了预施不同浓度Ca2+促进剂(Ca Cl2溶液)和Ca2+抑制剂(EGTA溶液),对低温胁迫下香蕉的类胡萝卜素以及几种抗寒指标的影响。同时,对香蕉环核苷酸门控通道(Cyclic nucleotide-gated channel,CNGC)进行了生物信息学以及定量表达分析,为阐明钙离子信号通路在香蕉低温胁迫过程中的作用机制奠定一定的基础。主要研究结果如下:1低温胁迫条件下Ma CNGC Ca2+促进剂和抑制剂对香蕉幼苗类胡萝卜素以及抗寒性相关生理指标的影响为研究钙离子通道促进剂和钙离子通道抑制剂对香蕉低温胁迫相关生理生化指标的影响,以‘巴西蕉’为材料,设置喷施4个Ca Cl2浓度:0(蒸馏水,CK),10 m M Ca Cl2,20 m M Ca Cl2和40 m M Ca Cl2,以及4个EGTA浓度:0(蒸馏水,CK),1 m M EGTA,2 m M EGTA和4 m M EGTA。然后,在4℃和28℃处理下,比较不同浓度的钙离子促进剂和钙离子抑制剂对香蕉叶片中类胡萝卜素、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的影响。结果表明:4℃低温胁迫下,20 m M Ca Cl2处理下香蕉幼苗叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量显著增加,激活了SOD和CAT活性,40 m M Ca Cl2促进了POD活性的积累,显著降低了MDA含量。同时,4 m M EGTA处理抑制了香蕉幼苗叶片中CAT活性的积累,增加了MDA含量,而类胡萝卜素含量、SOD、POD活性呈下降趋势,且在不同浓度的EGTA处理下差异不显著。研究结果说明:喷施钙离子信号通道抑制剂后,降低了CAT、POD、SOD活性,提高了MDA含量,加剧了膜脂过氧化的程度,抑制了类胡萝卜素的积累。而外源添加钙离子信号通道促进剂Ca Cl2能够提高细胞质膜的保护能力,提高了POD、CAT、SOD活性,降低了MDA含量,减缓了膜脂过氧化的程度,促进了叶绿素和类胡萝卜素的积累,从而提高香蕉抵抗低温胁迫的能力,表明钙离子信号通路在香蕉抗寒性中发挥着重要的作用。2香蕉CNGC的全基因组鉴定以及生物信息学分析研究发现:Ma CNGC家族共有17个成员,分布于除去2号染色体以外的所有染色体上,CDS区序列长度是1917bp~2247bp,平均为2118bp。氨基酸长度为638-748aa,平均为705aa。理论等电点(PI)为8.39-9.58,预测的分子量约为72.94-85.41 k Da。根据不稳定性指数(II),Ma CNGC的17个成员均为不稳定蛋白。所有的Ma CNGC成员具有跨膜结构,有13个成员均是亲水蛋白,绝大部分成员无信号肽。亚细胞定位预测的分析结果表明,Ma CNGCs均位于质膜上。进化树分析发现,香蕉可分为4个亚群(GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ和GroupⅣ)和两个亚组(GroupⅣ-A和GroupⅣ-B),与拟南芥类似。基因结构和蛋白序列比对分析表明,CNGC蛋白特异性结构域,即环状核苷酸结合结构域(CNBD)包括一个磷酸盐结合域(PBC)和一个高度保守的hinge区域。顺式作用元件和转录因子结合位点预测结果表明,Ma CNGC启动子区具有多种多样的植物激素以及跟逆境胁迫相关的响应作用元件,并且在香蕉中存在16种TFBS。3低温胁迫下Ma CNGC的表达模式分析转录组数据分析表明:在4℃胁迫24h后,与对照相比,76.47%的Ma CNGC成员的FPKM值下调表达;在0℃胁迫24h后,76.47%的Ma CNGC成员的FPKM值下调表达。综上可知,Ma CNGC家族成员在响应低温胁迫的过程中呈现下调的趋势,有待于深入研究。实时定量结果发现:与对照相比,82.35%的Ma CNGC基因成员在4℃/24h的表达量均受到负调控,这与转录组分析数据结果一致。其中,Ma CNGC1-1、Ma CNGC2-3、Ma CNGC15、Ma CNGC18-1和Ma CNGC18-2随着时间的增长对4℃胁迫的响应呈现下调趋势。在此基础上,利用q RT-PCR技术对Ca2+促进剂(Ca Cl2溶液)和Ca2+抑制剂(EGTA溶液)处理后,低温胁迫下Ma CNGC1-1、Ma CNGC2-3、Ma CNGC15和Ma CNGC18-2的表达模式进行分析,结果表明:相对低浓度的钙离子促进剂(20 m M Ca Cl2)对低温胁迫下Ma CNGC的表达量诱导显著,而2 m M的钙离子抑制剂EGTA对Ma CNGC的表达量起到抑制作用。这说明Ma CNGC的在响应低温胁迫的过程中可能发挥着重要的作用,拟将Ma CNGC1-1作为香蕉抗寒性研究的靶基因,更深层次地探讨Ca2+信号通路对香蕉抗寒机制的影响。
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