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背景和目的：骨肉瘤是多发于青少年的富含血管的高度恶性肿瘤之一，其疗效不佳，患者致死致残率比较高。临床上仍然采用以外科手术为主，术后辅助化疗等多种措施的综合治疗。目前，临床上用于骨肉瘤治疗的一线化疗药物仍为阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺为主，二线化疗治疗复发转移病例的疗效并不是很确切。也没有统一的标准二线方案。尽管有报道健择、多西紫杉醇和培美曲赛对复发的骨肉瘤显示了一定的治疗效应。分子靶向药物在肿瘤治疗领域发挥了重要作用，但将分子靶向药物运用于骨肉瘤的治疗尚少见报道。本课题应用免疫组化检测骨肉瘤组织中多个分子标志物的表达情况，并根据检测结果结合临床常用的分子靶向药物，检测这些靶向药物对骨肉瘤的治疗作用。为寻找可能的骨肉瘤治疗的新途径提供前期的理论基础。根据前期研究结果我们选择了mTOR的抑制剂雷帕霉素联合临床常见的多个化疗药物检测各种联合方案对骨肉瘤细胞的生长抑制及致死作用，希望能为骨肉瘤的治疗寻找新的途径提供一定的基础理论支持。方法：1、选取临床50例诊断明确的骨肉瘤患者组织蜡块，运用组织芯片和免疫组化技术检测APE1、VEGFR-2、mTOR、EGFR、PARP1、OGG1、BRCA1、RRM1、ERCC1、HER2、TS、β-tubulinⅢ、XRCC1、CD117、PDGFR-β共15个常见基因标志物在骨肉瘤组织中的表达情况，并结合临床资料及表达强弱分析各种标志物表达之间的相关性。2、运用MTT方法检测多个分子靶向治疗药物对人骨肉瘤HOS细胞的生长抑制作用，并结合RNA干扰技术敲低细胞APE1的表达后探讨mTOR受体抑制剂雷帕霉素对骨肉瘤细胞生长抑制效应的变化。3、采用MTT方法检测雷帕霉素、阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤4种药物对人骨肉瘤HOS细胞生长抑制率，并结合流式细胞技术探讨雷帕霉素联合三种常见骨肉瘤临床常见化疗药物诱导HOS细胞的凋亡的作用，明确药物联合运用的协同或拮抗效应。结果：(1)多个基因标志物在骨肉瘤组织中呈阳性表达，而TS仅有6例弱阳性表达，CD117仅有2例表达，HER2、β-tubulinⅢ无阳性表达。(2)阳性表达的标志物中，仅APE1表达与骨肉瘤的组织病理类型具有相关性(P＜0.05)。(3)等级相关分析当P＜0.05时， APE1和RRM1、OGG1和BRCA1、APE1和OGG1表达呈正相关，BRCA1和ERCC1表达呈负相关，相关系数分别为0.342、0.319、0.318、-0.324；在P<0.01，RRM1和XRCC1、APE1和XRCC1的表达也呈正相关，相关系数r为0.677、0.406。在P＜0.05时，APE1和mTOR表达呈正相关，相关系数r=0.366；mTOR和EGFR的表达也呈正相关，相关系数r=0.290；mTOR和PDGFR-β的表达强度呈正相关，相关系数r=0.311。其他标志物之间无表达强弱的相关性。(4)运用MTT方法检测ape1表达变化后细胞对特罗凯、雷帕霉素、多吉美的反应变化。其中特罗凯和多吉美作为临床常用的分子靶向药物未见对骨肉瘤细胞有明显的杀伤或抑制生长作用。而ape1表达变化的HOS细胞对雷帕霉素的半数抑制浓度发生了变化。(5)MTT法检测药物单独作用人骨肉瘤HOS细胞48小时后的半数抑制率IC50值分别为雷帕霉素为28.72±2.34nM、顺铂为2.278±0.137μg/ml、甲氨蝶呤为526.83±9.80mg/L、阿霉素为24.67±1.52μg/ml，选取两种浓度雷帕霉素分别和三种骨肉瘤一线化疗药物联合作用后根据金氏公式计算其q值分别为：雷帕霉素联合甲氨蝶呤q值分别为0.49、0.436、0.540、0.449；雷帕霉素联合顺铂q值分别为1.11、1.17、1.72、1.58；雷帕霉素联合阿霉素q值分别为0.89、0.75、0.77、0.71，根据金氏公式q值范围定义提示雷帕霉素分别联合甲氨蝶呤和阿霉素表现为两种药物相互拮抗作用，而雷帕霉素联合顺铂表现为两药协同增强(6)雷帕霉素联合顺铂处理HOS细胞24小时后，细胞早期凋亡率有较大提高，提示雷帕霉素联合顺铂治疗人骨肉瘤可能有协同效应。而雷帕霉素分别联合甲氨蝶呤、阿霉素处理细胞后凋亡率反而降低提示两种药物同雷帕霉素联合作用人骨肉瘤的治疗可能呈相互拮抗。结论：1、多个DNA损伤修复相关基因以及多种靶向药物治疗相关靶点基因在人骨肉瘤组织中均有高表达，其中APE1基因的表达强度同骨肉瘤组织病理类型有关。2、在阳性表达的基因中APE1和RRM1、OGG1、XRCC1、mTOR，OGG1和BRCA1、RRM1和XRCC1、mTOR和EGFR、PDGFR-β表达强度呈正相关性，而BRCA1和ERCC1的表达强度呈负相关。从而提示DNA修复途径中APE1可能在影响骨肉瘤化疗疗效中具有重要作用。而β-tubulin III和TS基因在骨肉瘤中呈阴性和低表达，预示抗微管药物和培美曲塞可能给骨肉瘤的治疗带来新的希望。3、分子靶向药物特罗凯和多吉美的治疗相关靶点基因EGFR、PDGFR-β、VEGFR-2在骨肉瘤组织中均有高表达，但是这两种分子靶向药物对人骨肉瘤HOS细胞的杀伤作用并不明显，提示这两种药物对骨肉瘤的治疗并无益处。4、mTOR基因在骨肉瘤组织中有高表达，其特异性的抑制剂雷帕霉素对抑制肿瘤细胞生长、杀伤肿瘤细胞有明显疗效。在不同APE1表达水平的人骨肉瘤HOS细胞中，雷帕霉素对肿瘤细胞的抑制作用表现出来了不同的敏感性，研究结果提示高APE1表达的骨肉瘤对雷帕霉素更敏感。同时也预示mTOR基因可能是治疗骨肉瘤的潜在靶点。5、检测雷帕霉素联合阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂三个单药抑制骨肉瘤HOS细胞生长时，雷帕霉素联合顺铂具有抑制肿瘤细胞生长协同效应，而雷帕霉素分别联合阿霉素、甲氨蝶呤时对肿瘤细胞生长的抑制具有药物拮抗效应。提示雷帕霉素联合顺铂可能是骨肉瘤治疗的一种新思路。