马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)，属真菌界，半知菌亚门，丝孢菌纲，丝孢目，青霉属，双轮青霉亚属。马尔尼菲青霉感染人体后引起的一种严重的深部真菌病——马尔尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PSM)。自DiSalvo首例报道之后，此真菌感染导致的疾病开始逐渐引起人们的重视。该病的发生有一定地域性，在艾滋病流行以前，较为罕见，主要在东南亚地区如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港和我国广西等地。近20年来随着免疫抑制剂的广泛应用、器官移植、AIDS等所导致的免疫缺陷宿主不断增多，马尔尼菲青霉病的报道也日渐增多，而且发病区域有扩大趋势。仅广州已发现马尔尼菲青霉病例近百余例，其中约50﹪以上与AIDS相关，已成为继广西省之后我国第二大马尔尼菲青霉病的重要流行区域。由于该病发病隐匿，病死率高达80﹪以上，并与AIDS高度相关，危害极大，所以已引起国内外真菌专家的重视。 马尔尼菲青霉是青霉属300多种青霉中唯一的双相型真菌，25℃生长为菌丝相，以无性孢子的方式繁殖；37℃则呈酵母相，以分裂的方式繁殖，至今未发现它的有性生殖期。马尔尼菲青霉的自然宿主为竹鼠及其洞穴周围的土壤，但它如何从自然界传播给人类尚未清楚。目前认为马尔尼菲青霉感染人体的可能的途径为孢子经呼吸道进入宿主，然后在人体37℃的环境下发生双相型转变产生致病性的酵母细胞，在免疫缺陷患者中侵范单核-巨嗜细胞系统并引起播散。在马尔尼菲青霉双相型转换中有以下两点是值得关注的，其一，在温度的诱导下，其酵母相与菌丝相之间可以两种形态相互转换，既可以从菌丝向酵母转换，也可以从酵母向菌丝转换。其二，分生孢子从呼吸道侵入宿主，肺泡巨噬细胞将之吞噬，分生孢子直接转变为酵母细胞，并没有经历从分生孢子出芽形成菌丝的过程。这些说明马尔尼菲青霉双相型转换受一系列温度变化开启的基因调控，其在体内的致病形式为酵母细胞，但具体的调控机制和毒力基因尚不明确。已有研究表明马尔尼菲青霉的致病性与其双相型转变密切相关。这两种生长形态的改变可以使一些基因的表达水平发生改变，以调节马尔尼菲青霉细胞的分化及形态的转变。一些有可能在双相型转变中起关键作用基因被详细的研究，如abaA基因，cflA(CDC42 homolog)基因和TupA基因等，这些研究对其形态形成的分子机制具有一定的提示作用，但尚未发现对双相型转换起直接调控作用的基因。所以全面而细致的寻找马尔尼菲青霉双相间的差异性表达基因有可能为揭开马尔尼菲青霉形态转变的秘密及进一步寻找其致病相关基因提供一些帮助。 抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)主要通过消减杂交将待比较双方共同的cDNA进行消减，再通过抑制性PCR技术扩增在Tester中特异表达的cDNA片段，使其得到大量富集。抑制性消减杂交技术是当今研究基因差异表达最为有效的工具之一。迄今为止，已经广泛的应用于肿瘤、植物及致病真菌等的研究中。 本课题以马尔尼菲青霉的双相性转换为切入点，除了介绍马尔尼菲青霉的生物学特性及分子生物学鉴定方法外，还将SSH技术应用于寻找马尔尼菲青霉菌丝相与酵母相的差异表达基因的研究中，为进一步寻找其致病相关基因、探讨致病性作一些基础研究，也希望为马尔尼菲青霉病的致病机制深入研究提供一些资料。 第一部分马尔尼菲青霉生物学特性研究及分子生物学鉴定方法。 1.1马尔尼菲青霉生物学特性研究马尔尼菲青霉在五种培养基上的生长情况：将马尔尼菲青霉菌株SUMS0152、SUMS0050、SUMS0215、SUMS0222接种于SDA、PDA、BHI、CDA、CMA五种不同的培养基上，然后分别放置在25℃和37℃培养两周。在25℃，四株马尔尼菲青霉在五种培养基上均生长良好，但在不同培养基上生长速度，色素产生情况，菌落形态及显微镜下形态有所不同。在37℃，马尔尼菲青霉均生长为酵母状菌落，无色素产生，但在不同的培养基上转化为酵母细胞的能力不同。马尔尼菲青霉在SDA培养基上不同温度下的生长情况：四株马尔尼菲青霉在6℃和10℃菌落生长减慢，产生色素减少，18℃及28℃生长良好，产生大量红色色素。在37℃为酵母状菌落，生长较快，但容易死亡，在40℃未发现生长。 放线菌酮耐受试验：四株马尔尼菲青霉在含有放线菌酮(浓度0.1﹪，0.05﹪)的SDA培养基上25℃和37℃均未见生长，在含0.01﹪放线菌酮的培养基上缓慢生长。 尿素酶产生情况：四株马尔尼菲青霉在37℃的尿素酶试验均为阴性。 1.2马尔尼菲青霉的ITS序列测定采用来源于真菌核糖体大亚基基因保守区的通用引物ITS5和ITS4，PCR扩增四株马尔尼菲青霉的rDNAITS区。四株马尔尼菲青霉的均能扩增出600bp左右的片段，将PCR产物进行测序，序列在Genbank中应用Blastn进行查询，所有菌株均与马尔尼菲青霉的标准株具有100﹪同源性。ITS序列分析是一种快速、准确的鉴定马尔尼菲青霉的分子生物学方法。 第二部分马尔尼菲青霉抑制性消减文库的建立。 1.1马尔尼菲青霉总RNA提取方法的比较利用Rneasy Plant Mini Kit，Trizol，改良的异硫氰酸胍法，RNAex四种方法提取马尔尼菲青霉双相的总RNA，以寻找一种合适的方法用于建立抑制性消减文库。结果显示四种方法提取的RNA均较为完整，但相同重量的菌体所提取的RNA产量、质量及所用时间和价格皆有差异。通过比较，发现Trizol提取的RNA具有完整性和纯度均较好，产量较高，操作相对简便，价格适中等优点，可用于有效的建立抑制性消减文库。 1.2马尔尼菲青霉抑制性消减文库的建立利用SMART技术将马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相的总RNA合成cDNA并进行Rsal酶切。然后应用抑制性消减杂交技术(SSH)，连接不同的接头，通过两轮杂交和两次抑制性PCR后，将产物与pMD18-T载体连接并转染大肠杆菌。经PCR鉴定，共得到1200余条插入片段。成功构建了马尔尼菲青霉的正向消减文库(以酵母相为tester，菌丝相为driver)和反向消减文库(以菌丝相为tester，,酵母相为driver)。 第三部分马尔尼菲青霉差异表达基因的筛选及初步功能研究。 从马尔尼菲青霉正向消减文库和反向消减文库选取500个cDNA片段进行cDNA斑点杂交。共在正向文库中筛选出46个阳性克隆，反向文库中筛选出35个阳性克隆。经测序分析及Blastx查询，这些基因按其功能可以分为细胞壁合成、信号转导、细胞循环、物质转运、基础代谢、应激反应等几大类。应用相对定量real-time PCR寸六个代表性基因进行了进一步的研究。我们推测在温度改变时，马尔尼菲青霉的信号传导通路被开启，相应的基因表达上调，这些基因决定了马尔尼菲青霉双相型的一些特征。