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第一部分VEGF抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转化作用中Notch信号系统的变化研究背景与目的肾间质纤维化是各种慢性肾脏病发展至终末期肾衰竭的共同病理过程。。肾小管上皮细胞-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是肾间质纤维化的重要的机制之一。EMT受多种因素调节,既有促进EMT的因子,也有对EMT起抑制作用的因子。TGF-β1是促进EMT的重要细胞因子。Notch信号传导在TGF-β1诱导肾小管EMT过程中发挥重要作用。我们前期研究发现VEGF对TGF-β1诱导的肾小管EMT有抑制作用,但具体作用机制尚不十分清楚。VEGF可调节血管内皮细胞Notch信号分子表达。在血管新生过程中,VEGF、TGF-β1和Notch存在交互对话。Notch信号途径可能是VEGF抑制TGF-β1诱导肾小管EMT的作用靶点之本研究旨在探讨应用VEGF干预TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT过程中Notch信号系统的变化及其意义。方法实验1：体外培养的HK-2细胞分为TGF-β1(5μg/L)单独作用组(T组)和TGF-β1(5μg/L)与VEGF (100μg/L)共同作用组(T+V组),应用RT-PCR方法检测作用0、2、4、8、24小时Jagged-1和α-SMA mRNA表达,应用Western blot方法检测0、2、4、8、12、24、48小时Jagged-1和α-SMA蛋白表达。实验2：体外培养的HK-2细胞分为阴性对照组、TGF-β1 (5μg/L)单独作用组、VEGF165 (100μg/L)单独作用组、TGF-β1 (5μg/L)与不同浓度VEGF165(0.1、1、10、100μ/L)共同作用组,作用细胞24小时,应用免疫组化双染观察α-SMA和E-cadherin蛋白表达,激光共聚焦显微镜方法观察α-SMA蛋白表达,应用RT-PCR、Western Blot检测细胞α-SMA、Jagged-1、Notch1 mRNA和蛋白表达。结果1.不同作用时间VEGF对TGF-β1诱导的α-SMA及Jagged-1表达的影响T组a-SMA mRNA表达在作用后2小时较基础值明显升高,T+V组则在8小时后才明显升高；T组α-SMA蛋白表达在作用后4小时较基础值明显升高,T+V组则在12小时后才明显升高；作用后24和48小时,T+V组α-SMA蛋白表达明显低于T组。T组Jagged-1 mRNA表达升高呈双峰样,即在作用后4和24小时较基础值明显升高,而8小时无明显变化,T+V组Jagged-1 mRNA表达也在4和24小时明显升高,但各时点表达均有低于T组的趋势；T组Jagged-1蛋白表达在作用后4小时较基础值明显升高,T+V组则在8小时后才明显升高；作用后24和48小时,T+V组Jagged-1蛋白表达明显低于T组。2.不同浓度VEGF165对TGF-β1诱导的E-cadherin、a-SMA、Jagged-1及Notch1表达的影响免疫组化双染显示,TGF-β1作用后,HK-2细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强。同TGF-β1作用组比较,VEGF165 (100μg/L)与TGF-β1共同作用组α-SMA表达明显减弱而E-cadherin表达明显增加。随VEGF165浓度下降,α-SMA表达逐渐增加而E-cadherin表达逐渐减弱。激光共聚焦显微镜观察发现,TGF-β1作用后,HK-2细胞胞浆α-SMA表达明显增强。同TGF-β1作用组比较,VEGF165(100μg/L)与TGF-β1共同作用组a-SMA表达明显减弱,随VEGF165浓度下降,α-SMA表达逐渐增加。RT-PCR、Western Blot结果显示,与TGF-β1单独作用组相比,TGF-β1与VEGF165 (100μg/L)共同作用组,a-SMA、Jagged-1及Notch1 mRNA和蛋白表达较TGF-β1 (5μg/L)单独作用组均明显降低(P<0.05)。随着VEGF165浓度下降,对a-SMA、Jagged-1及Notch 1表达的抑制作用减弱。VEGF165单独作用组与阴性对照组相比,Jagged-1及Notch1表达无明显差异。结论VEGF以剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的HK2细胞发生EMT,并同样以剂量依赖方式下调HK2细胞发生EMT过程中Jagged-1、Notch 1分子表达,提示该效应可能为VEGF抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的机制之一。第二部分舒洛地特对UUO小鼠肾间质纤维化的作用及其机制探讨研究背景与目的众所周之,肾间质纤维化是导致各种慢性肾病疾病进展至终末期肾衰竭的重要机制。肾小管上皮细胞-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)在肾间质纤维化发生发展中起重要作用。EMT受多种因子调节,其中TGF-β1是促进EMT和肾间质纤维化的重要细胞因子,研究证实Notch通路是TGF-p1诱导肾小管EMT过程中的重要信号途径；而VEGF等因子可抑制肾小管EMT和肾间质纤维化。舒洛地特是从猪小肠粘膜提取的天然物质,由四种糖胺聚糖组成。已有研究证实舒洛地特可影响试验动物和人体TGF-β1、TNF-α、HGF等EMT和肾间质纤维化相关细胞因子、生长因子表达。动物实验提示多种糖胺聚糖类物质可抑制器官纤维化,但不同种类糖胺聚糖及不同动物模型其结果不尽一致。目前尚无舒洛地特对肾间质纤维化作用的报道。本研究旨在探索舒洛地特对单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾脏间质纤维化的作用,及其对EMT和肾组织Jagged-1、Notch 1表达的影响,探讨其可能机制。方法雄性CD1小鼠78只随机分为：A.假手术组(腹膜切开后缝合)；B.UUO+NS(单侧输尿管结扎,术后予生理盐水0.1ml/d皮下注射)；C. UUO+LS(?)(单侧输尿管结扎术后予舒洛地特6mg/kg/d皮下注射,)；DUUO+HS(单侧输尿管结扎术后予舒洛地特12mg/kg/d皮下注射)；E. UUO+3dHS(单侧输尿管结扎术后第三天予舒洛地特12mg/kg/d皮下注射)。A、B、C、D组动物分别于术后第3天、7天、14天处死6只,E组6只于术后第7天处死,取输尿管结扎侧肾皮质组织。肾脏标本行HE、Masson染色检测肾间质纤维化程度。应用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测肾脏组织中α-SMA、TGF-β1、VEGF、Jagged-1和Notch1表达。结果HE染色显示,UUO术后肾脏间质区域细胞外基质成分逐渐增多,肾小管萎缩,细胞成分减少,而肾小球病变不明显。舒洛地特治疗后UUO小鼠肾脏组织学变化减轻,大剂量组效果更为显著。Masson染色显示,UUO组小鼠肾组织出现明显肾间质纤维化,舒洛地特抑制肾间质纤维化(P<0.001),且早期治疗组(D组,7d)较晚期开始治疗组(E组)肾间质纤维化程度明显较轻(P<0.05)。与假手术组比较,UUO组肾组织a-SMA、TGF-β1和Jagged-1 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)；舒洛地特治疗组a-SMA、TGF-β1和Jagged-1 mRNA及蛋白表达明显低于UUO组(P<0.05)。UUO组和假手术组比较,VEGF mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),舒洛地特治疗后VEGF mRNA及蛋白表达无明显变化。未检测出小鼠肾组织中Notchl表达。结论舒洛地特可抑制UUO小鼠肾间质纤维化,且早期治疗效果较好。这可能与舒洛地特抑制UUO小鼠肾组织EMT有关,而EMT的减轻可能与UUO肾组织TGF-β1、Jagged-1表达下调有关,VEGF在其中的作用尚不明确,其确切机制需进一步探讨。