硒(selenium, Se)是动物体生命活动中所必需的微量元素,对动物体正常生理功能的发挥起着重要作用。硒与人和动物的健康密切相关,硒缺乏能够引起人的地方病-克山病,及牲畜的白肌病等。硒对脑组织功能的正常发挥也是至关重要的。缺硒与神经退行性疾病密切相关,如癫痫、帕金森症(PD)和阿尔茨海默病(AD)。禽类硒和维生素E缺乏可引起脑软化。硒以硒蛋白(selenoprotein)的形式在动物体内发挥其生物学功能,到目前为止,已经鉴定出17个家族中的30多个硒蛋白基因。硒蛋白W (SelW)是硒蛋白家族的一员,在多种动物的不同组织中均有表达,动物的脑组织中SelW的表达量较高,特别是在胚胎脑组织的发育过程中,SelW的表达优先于其他硒蛋白。目前鸡SelW被证明具有抗氧化的作用,然而SelW在鸡缺硒性脑组织损伤中的作用机制仍不清楚。为了进一步研究SelW的生物学功能,本研究在建立鸡缺硒模型和体外培养鸡胚脑神经元SelW基因敲低和过表达模型的基础上,通过相关指标的检测,旨在阐明SelW在鸡缺硒性脑损伤中的作用机制,本研究设置试验内容如下：1日龄公雏鸡200只,随机分2组,每组100只。L-Se组为缺硒组,饲喂缺硒日粮(饲料来源于黑龙江省严重缺硒地区龙江县,日粮总含硒量为0.033mg/kg); C-Se组为硒正常组,饲喂全价日粮(于缺硒组日粮中添加亚硒酸钠(Na2Se03),使日粮含硒量为0.15mg/kg),饲喂期为55d。分别于15、25、35、45和55日龄,两组各取15只,将鸡颈静脉放血处死,剖杀后采集大脑灰质、大脑白质、脑脊髓、小脑、丘脑和脑干组织样本。样本采集后,一部分立即进行组织匀浆,进行抗氧化指标的检测；一部分固定于10%的福尔马林磷酸盐缓冲液中,用于组织细胞凋亡的TUNEL法检测；剩余组织样本,保存于-80℃,用于实时定量PCR (qPCR)分析和western-blot蛋白检测。采用改良后的细胞分离培养方法,分离培养鸡胚脑神经元。利用噻唑蓝法(MTT)测定鸡胚脑神经元的H202半数致死量(LD5o)。分离培养后的鸡胚脑神经元利用BLOCK iTTM Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo和绿色荧光真核表达载体(PcDNA3.1/PEGFP)优化细胞转染条件后,转染SelW小干扰RNA (siRNA)和SelW真核表达载体(PcDNA3.1/SelW),建立鸡胚脑神经元SelW基因敲低和过表达模型。根据鸡胚脑神经元H2O2LD50设置H202浓度10、20和50μM,对正常鸡胚脑神经元和两个细胞模型施以外源性氧化物刺激24h后,利用qPCR法对目的基因mRNA表达水平进行检测与分析。本试验在复制缺硒鸡模型与建立体外培养鸡胚脑神经元Se1W敲低与过表达模型的基础上,采用qPCR法,分别检测SelW、凋亡因子(P53、caspase-3、Bax、Bak-1、Bcl-2) mRNA以及炎症因子(cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS、NF-κB) mRNA表达水平;Western blot法检测了cox-2、PTGEs、NF-κB、caspase-3、Bax、Bcl-2和SelW基因蛋白的表达变化量;TUNEL法和AO/EB法检测了脑组织细胞和鸡胚脑神经元凋亡的程度,结果表明：1.抗氧化指标检测结果显示,鸡脑组织中GSH含量、H202含量、NO含量、MDA含量、iNOS含量以及羟自由基含量升高;GSH-Px活性、CAT活性下降。结果表明,鸡脑组织抗氧化能力的降低是低硒致鸡脑损伤的作用机制之一。2.利用qPCR法检测鸡胚脑神经元SelW基因敲低和过表达模型中SelW mRNA的表达变化量,结果显示：将pcDNA3.1/SelW以每孔4μL转染试剂和1μg的表达载体的最佳转染比例,转染到六孔板中培养的鸡胚脑神经元中,过表达细胞中SelW的含量比正常组中高3-4倍；以六孔板中每孔30nM siRNA+3μL siRNA的最佳转染比例,将siRNA转染到鸡胚脑神经元中,SelW的表达量为正常组的50%左右。试验结果证明鸡胚脑神经元SelW基因敲低和过表达模型建立成功。3.缺硒鸡脑组织中P53、caspase-3、Bax、Bak-1mRNA的表达量增加,而Bcl-2mRNA的表达随着时间的推移呈现先升高后降低的趋势；与正常组相比,统计学上目的基因表达变化量差异显著(P<0.05)。体外试验中,细胞过表达SelW时,P53、caspase-3、Bax、Bak-1mRNA的表达量比对照组低,而Bcl-2的表达量升高,而敲低组中,P53、caspase-3、 Bax、Bak-1mRNA的表达量增加,Bcl-2mRNA的表达量降低,统计分析结果显示各组之间目的基因表达变化量差异显著(P<0.05),并且过表达组细胞的凋亡率明显低于沉默组。体内和体外试验中,caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白变化水平与mRNA变化水平一致。试验结果表明,SelW能够抑制促凋亡因子的产生,促进抗凋亡因子的表达,从而保护脑组织免受氧化应激导致的凋亡损伤。4.缺硒鸡脑组织中cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS及NF-κB mRNA的表达量比对照组高,统计分析结果显示两组之间目的基因表达变化量差异显著(P<0.05),并且cox-2、 PTGEs及NF-κB蛋白变化水平与mRNA变化水平一致；体外试验中,细胞过表达SelW时,cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS及NF-κB mRNA的表达量比对照组低,并且cox-2、 PTGEs、NF-κB蛋白的表达量也降低,而细胞敲低SelW组中,cox-2、PTGEs、TNF-α、 iNOS及NF-κB mRNA的表达量升高,其蛋白检测结果与mRNA变化水平一致。试验结果证明,SelW能够抑制NF-κB通路激活因子的表达,同时通过抑制NF-κB通路的激活,进而抑制其下游促炎因子的表达,从而保护脑组织免受氧化应激导致的炎性损伤。综上所述,本次研究结果表明硒缺乏可以导致鸡脑组织损伤,SelW通过抑制炎性因子和凋亡基因的表达,保护脑组织免受氧化应激导致的炎性损伤和凋亡损伤。低硒导致的鸡脑组织中SelW表达量降低,使鸡脑组织抗氧化能力降低,可能是低硒致鸡脑组织损伤的作用机制之一。