猪圆环病毒2型(porcine circovirus vius type2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated diseases,PCVD/PCVAD)的主要致病原,在世界范围内广泛流行,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2是属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus)的单链环状DNA病毒。猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)不仅是PCV2的靶细胞,而且是重要的免疫细胞。PCV2不仅可以在PAM传代细胞系3D4/21和3D4/31上存活,而且可以在PAM传代细胞系上增殖。有研究表明PCV2可以诱导感染的PK15细胞自噬促进病毒复制,但是,PK15不是免疫细胞,更不是PCV2的靶细胞,因此该研究的临床意义有限。自噬和病毒两者之间的研究已取得相当大的进展,但自噬究竟正调控还是负调控病毒感染还有待于进一步阐明。自噬对于病毒感染就是一把“双刃剑”,自噬可以发挥自身的防御机制,通过自噬相关基因等调控宿主抗病毒免疫反应,有助于机体清除病毒;亦可作为病毒增殖的储存库和感染细胞逃避凋亡和死亡的助手,促进病毒增殖。此外,即使是同一病毒,自噬和病毒之间的关系也可能因为靶细胞特异性不同而不同。MicroRNAs(miRNAs)是一类非蛋白质变性小RNA分子,在基因转录后水平调控目的基因功能。miRNAs的表达直接或间接调控自噬,成为研究自噬的新视角。miRNAs对自噬或者病毒而言也是一把“双刃剑”,miRNAs既可以促进自噬,也可以抑制自噬影响病毒增殖;miRNAs对病毒的增殖,既具有正调控作用亦具有负调控作用。为了探讨PCV2、自噬和miRNAs之间的关系,本文拟以猪PAM细胞系3D4/21为模型,对自噬过程中的PAM进行miRNAs差异表达分析;预测差异表达miRNAs的靶基因并进行验证,绘制靶基因调控网络,确立调控病毒在PAM中复制和自噬的miRNAs:通过miRNA与靶基因mRNA相互作用的功能学验证,确立miRNA对靶基因生物学功能的影响;确认miRNAs、病毒和自噬之间的相互作用。1.2010-2015年江苏省及周边地区PCV2的分子流行病学分析本研究利用PCR方法对近几年江苏及周边地区的384份断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)疑似发病猪进行检测,发现江苏及周边地区普遍存在PCV2的感染,感染率可达41.15%。获得的42株序列与11株参考毒株的系统进化树分析表明,基于ORF2和全长核苷酸序列构建的系统进化树结构是基本一致的。获得的42株序列的ORF2和全长核苷酸同源性分别介于87.0-100.0%和 89.6-100.0%之间,可分为 3 个基因型,即 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d,基因型分布无地域差异;PCV2d为优势基因型,在江苏、安徽和浙江都广泛存在。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,42株序列在特异性抗原表位都存在一定程度的变异,尤其是aa77和aa206两个抗体识别关键点的突变,这些突变是否会影响PCV2的致病性等生物学特性还有待进一步深入探讨。PCV2 Cap序列因所属基因型不同而差异显著,但是同一基因型内存在一些代表性突变位点。本文还成功分离得到一株PCV2毒株,2010AHCY株,属于当前优势基因型PCV2d,为后续研究的开展提供了研究对象。总之,这些结果为探讨中国PCV2的基因多样性、遗传变异性和致病性提供了理论基础。2.PCV2感染3D4/21细胞自噬过程中miRNAs差异表达谱及靶基因调控网络的研究PAM不仅是PCV2的靶细胞,而且是重要的免疫细胞。PCV2可以感染PAM、并引起凋亡,逃避细胞免疫识别引起免疫抑制,而自噬可抑制凋亡产生。病毒可通过miRNAs干扰宿主细胞的正常免疫过程,实现免疫逃逸。因而,我们设想PCV2感染可能会引起miRNAs调控的改变和巨噬细胞发生自噬,从而抑制凋亡产生,逃避免疫,引起免疫抑制。本文研究结果表明,PCV2感染3D4/21细胞和自噬之间存在着正相关性,PCV2感染诱导的自噬促进了PCV2的感染。经高通量测序,获得miRNAs和mRNAs表达谱,发现PCV2感染与自噬由多个miRNAs调控,经RT-PCR、miRNA模拟物(mimics)与抑制物(inhibitors)等系列试验筛选miRNAs,发现多个miRNAs参与调控病毒生命周期。根据miRNA mimics对病毒的作用,本文侧重研究miR-30a-5p在病毒感染和细胞自噬中的作用。过表达miR-30a-5p能够显著促进PCV2的感染和自噬现象,且具有浓度依赖性。抑制miR-30a-5p的表达显著降低了 PCV2的复制也验证了这一结果。进一步的研究表明miR-30a-5p具有调节PCV2感染和宿主免疫系统的作用。此外,miR-30a-5p并不直接靶向PCV2基因组,而是靶向宿主14-3-3基因,通过调节细胞周期影响PCV2的复制和自噬。这些发现不仅为研究PCV2感染过程中病毒与宿主之间的关系提供了新的思路,也为防治PCV2感染提供了新的抗病毒策略。