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猪胸膜肺炎（Porcine pleuropneumonia）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪高度传染的呼吸道疾病。APP具有18种血清型及多种毒力因子。目前市场上常见的猪胸膜肺炎疫苗为灭活疫苗和亚单位疫苗,但都存在不同程度的缺陷:灭活疫苗交叉保护力不足,亚单位疫苗免疫保护性因子有限,不能完全排阻细菌定植和持续感染。因此,有待进一步了解APP的致病特点,发掘更具有免疫保护潜力的抗原,以便开发更为有效的疫苗。研究显示,多种APP外膜脂蛋白在APP各种血清型中较为保守,被认为是潜在的疫苗候选蛋白。本实验旨在筛选并鉴定APP免疫保护性强的脂蛋白,为开发高效亚单位疫苗奠定基础。现将研究过程和主要结论简述如下:1.脂蛋白克隆表达引物的设计:本实验在前期研究中,通过生物信息学方法,从APP血清3型菌株JL03中,筛选到60个可能的脂蛋白,并对脂蛋白Lip40和PaIA的生物学特性进行了分析。因此,本研究将对余下的58个脂蛋白的免疫活性进行详细分析。经过序列分析,通过合理地去除了脂蛋白信号肽序列,引入合适的酶切位点,设计了脂蛋白克隆表达的引物。2.脂蛋白原核表达载体的构建:以APP JL03菌株基因组为模板,通过PCR扩增出58个脂蛋白基因。将58个脂蛋白基因片段连入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,鉴定正确后提取质粒,并双酶切出正确的脂蛋白基因片段,连入原核表达载体pGEX-KG,构建重组表达质粒。最终获得了 55个表达质粒。3.重组脂蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析:将构建成功的55个脂蛋白重组表达质粒转化E.coli BL21菌株,IPTG诱导重组脂蛋白超量表达,共有47个脂蛋白基因能够在大肠杆菌中表达。其中37个重组脂蛋白为可溶性表达,10个重组脂蛋白为非可溶性表达。用亲和层析法,纯化37个可溶性重组脂蛋白,并通过免疫印迹法,鉴定蛋白的免疫反应性。经鉴定,共有31个重组蛋白具有免疫学活性。本研究从中筛选出免疫反应性较强的5个脂蛋白（APJL 0386,APJL 0922,APJL 1380,APJL 1740和APJL 1976）,进行进一步分析。4.对小鼠的免疫保护性的鉴定:以筛选到的5个免疫学活性较好的脂蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,共免疫两次,然后用APP血清1型4074菌株对小鼠攻毒,以检验这5种脂蛋白的交叉保护作用。通过ELISA和WesternBlot检测小鼠体液免疫应答水平,发现各组免疫原能激发特异性免疫应答。APJL 1380、APJL 1976、APJL 0922、APJL 0386、APJL 1740对小鼠的保护率分别为92%、75%、75%、25%和42%。小鼠肺组织病理切片显示,以GST和PBS免疫的肺组织显示出动物急性和出血性肺炎病症,而免疫组中存活下来的小鼠显示出健康的肺切片。以主动免疫获得的免疫血清被动免疫BALB/c小鼠后,进行攻毒。针对蛋白质APJL1380、APJL1976、APJL0922、APJL0386和APJL1740的抗血清对小鼠的保护率分别为83%、92%、67%、33%和25%。病理切片结果同主动免疫结果相似,抗脂蛋白血清组小鼠显示出健康的肺切片,而抗GST和PBS血清组显示出明显的肺部病变。通过本研究,从APP菌株中,筛选出APJL0922、APJL1380和APJL1976这3个候选抗原,具有良好的免疫原性,能诱导动物产生高水平的体液免疫应答,且具有较高的免疫保护效力。这三个蛋白有望用于开发新的高效胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗,为猪胸膜肺炎的防控奠定基础。