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脂联素及其受体存在多种动物的生殖腺及生殖组织中,在调控动物生殖及胚胎生长发育方面起重要作用。目前相关研究大多集中在哺乳动物上,对家禽的生殖机能的研究比较少。颗粒细胞是作为研究禽类卵泡发育相关研究良好的试验模型。因此本实验以海兰褐蛋鸡为试验材料,采用qRT-PCR、Western blot(WB)技术在体外研究脂联素受体激动剂(AdipoRon)及脂联素受体(AdipoRs)在鸡卵巢颗粒细胞中的生物学作用及调控机制,为完善家禽生殖调控理论奠定基础。相关研究结果如下:试验一 AdipoQ及AdipoRs基因在鸡组织和卵巢中的表达分布情况1、采用qRT-PCR技术研究AdipoQ及AdipoRs在鸡体各组织和卵泡的表达情况。结果显示:AdipoQ及AdipoRs广泛存在于鸡的各种组织和卵泡中。AdipoQ在下丘脑和脂肪的表达量最高,AdipoR1主要在腿肌和下丘脑表达,AdipoR2主要在下丘脑和垂体中表达。AdipoR1在F3中的表达量最低,在SWF、SYF、LWF中表达量最高;AdipoQ在F1和SYF卵泡中的表达量最高,AdipoR2在F1和F2卵泡中的表达量最高。说明脂联素及其受体参与生命活动和卵巢卵泡发育的过程。2、qRT-PCR检测结果显示脂联素及其受体存在于颗粒细胞和膜细胞中,AdipoQ在颗粒细胞中的表达量最低,AdipoQ mRNA在膜细胞中的表达水平比颗粒细胞高出40倍左右(P<0.001)。膜细胞中AdipoR1 mRNA表达水平较颗粒细胞低约2倍(p<0.05)。3、免疫组化结果显示,AdipoQ在卵巢颗粒细胞和膜细胞都有分布。AdipoR1、AdipoR2在卵巢髓质部有分布。试验二AdipoRon对原代卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响1、血清和卵泡液中均存在脂联素及其受体。AdipoQ(14.3 1±1.81)在血清中的分泌水平最高。2、通过CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,结果发现AdipoRon(5ug/mL和10ug/mL)作用卵巢颗粒细胞24h对其活力和凋亡没有影响,因此可以作为后续试验。3、本试验利用酶消化法分离得到原代卵巢颗粒细胞,待贴壁12h后,用0(对照组)、5、10ug/ml AdipoRon处理原代卵巢颗粒细胞24h,采用ELISA方法检测细胞培养液生殖激素分泌量。结果显示:AdipoRon影响了生殖激素的分泌。AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)显著抑制了E2的分泌(P<0.05),显著刺激了LH、FSH、PROG、AdipoR1、AdipoR2、GnRH分泌(P<0.05)。试验三过表达或干扰AdipoRs和AdipoRon共处理对原代卵巢颗粒细胞的影响过表达或干扰AdipoRs与AdipoRon联合作用鸡卵巢颗粒细胞24h对其生殖激素及受体等相关基因表达的影响。结果显示:1、AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)单独处理颗粒细胞显著增加了ACC、P450SCC0、STAR、CYP19A1 mRNA水平(P<0.05),FSHB、AdipoR2、LHR、FSHR、P38MAPK表达都有上升趋势(P>0.05)。AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)单独处理颗粒细胞显著抑制了E2的分泌(P<0.05),显著刺激了AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、GnRH、FSH、LH、PROG分泌(P<0.05)。我们推测在鸡卵巢颗粒细胞中,AdipoRon可促进LH与LHR受体的结合,从而刺激卵巢卵泡的发育和排卵。2、干扰AdipoR1或AdipoR2分别与AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)联合作用颗粒细胞可显著升高FSHR、LHR的表达,促进FSH与LH的分泌。因此促进小卵泡的发育,刺激类固醇激素的分泌。过表达AdipoRs显著刺激了 LH的分泌,降低了 LHR的表达,对FSHB、STAR、GnRH mRNA水平没有影响。AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)、过表达AdipoRs和AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)共处理都增加了GnRH的表达,促进了GnRH分泌。在颗粒细胞中过表达AdipoRs和AdipoRon联合、单独添加AdipoRon或过表达AdipoR2都提高了 P38MAPK mRNA水平,过表达AdipoR1、干扰AdipoR2显著降低了P38的表达(P<0.05)。可以推测脂联素参与了鸡颗粒细胞P38信号通路,在家禽早期发育中具有生理作用。3、过表达AdipoRs都显著促进了AdipoRs的分泌,干扰AdipoRs显著抑制了AdipoRs的分泌。过表达或干扰AdipoRs分别与AdipoRon(5ug/ml、10ug/ml)联合作用颗粒细胞显著抑制了E2的分泌,促进了AdipoR1、AdipoR2、GnRH、FSH、LH、PROG的分泌(P<0.05)。此外,过表达AdipoR1或AdipoR2都显著促进了AdipoR1和AdipoR2的分泌,抑制AdipoQ的分泌(P<0.05),脂联素的分泌与AdipoR1、AdipoR2 mRNA丰度呈负相关。AdipoRs过表达或干扰分别与AdipoRon联合都促进了孕酮的分泌,促进卵泡的排卵。综上所述:脂联素及其受体参与生命活动和卵巢卵泡发育的过程,调控生殖相关基因的表达,促进类固醇激素的分泌,从而促进了卵巢的发育和排卵。