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氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)系从芸香科植物两面针(Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC. )的根中提取的苯骈菲啶类生物碱。本课题组前期大量研究表明,氯化两面针碱具有很好的抗肿瘤活性,在体外能显著抑制鼻咽癌、口腔鳞癌、肺癌等细胞的增殖。氯化两面针碱的体内抗肝癌活性目前未见国内外相关文献报道,本课题采用体内、外相结合的方法,分别从整体、细胞、分子水平上,研究了氯化两面针碱的抗肿瘤作用及其作用机制。目的:1.考察NC对多种肿瘤细胞的抑制增殖作用并探讨其分子机制。2.通过荷瘤动物实验,考察NC体内抗肝癌效应,采用基因芯片技术初步探讨其作用机制。3.研究NC对拓扑异构酶(Topo)的抑制作用方法:1.应用MTT法研究NC体外对22株人肿瘤细胞及3株多药耐药细胞株生长的影响。2.采用S180肉瘤、H22肝癌(腹水型)小鼠模型以及人肝癌HePG2裸小鼠移植瘤模型评价氯化两面针碱的体内抗肿瘤活性。3.应用吖啶橙荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法、Annexin V-FITC/PI双染法等方法研究NC对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响。4.透射电镜观察肿瘤细胞超微结构,TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡。5.采用基因芯片技术分析NC作用人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤后基因的变化情况,实时荧光定量PCR确证芯片研究结果的可靠性。6.采用质粒pBR322解旋反应考察NC对Topo I和Topo II催化活性的影响,应用免疫组化法研究肿瘤组织中Topo I和Topo II的蛋白表达变化。结果:1. NC对多种组织类型包括消化、呼吸、生殖、乳腺等多个系统来源的肿瘤细胞生长均具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系,平均IC50值为5.52±1.42μM。NC还对3株多药耐药细胞株(BEL7404/ADR、KBV200和BEL7402/5-Fu)及相应的亲本细胞株表现出同等程度的生长抑制作用,平均耐药因子(RF)为1.03,显著低于阿霉素(ADR)、长春新碱(VCR)和氟尿嘧啶(5-FU)的RF。2. NC各剂量组(2.5、5、10 mg·kg-1)对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别为1.95%、27.3%和42.9%;NC能显著延长H22腹水型肝癌小鼠的生存期,各剂量组的生命延长率分别为35.7%、71.4%、85.7%;NC各剂量组对人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的抑制率分别为12.06%、35.63%、60.91%。这些结果表明NC在体内可发挥较好的抗肿瘤作用。3. NC各剂量组(0.75、1.5、3μM)对细胞周期的影响表现为G2/M期阻滞,作用肝癌HepG2细胞24h后的凋亡指数分别为17±1.23%、25.2±3.52%、35.9±3.19%,明显高于NS对照组(0.29±0.11%)。吖啶橙荧光染色可见细胞出现明显的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA lader。4.电镜下可见NC给药组肿瘤细胞核染色质浓缩并边缘化,核碎裂,胞浆空泡化明显;TUNEL染色凋亡细胞明显增多,凋亡指数为27.5±3.6%。表明NC能够诱导肝癌细胞发生凋亡。5. NC治疗肝癌后差异表达的基因共有369个,其中上调基因183个,下调基因186个。差异表达基因涉及细胞增殖与凋亡调控、细胞周期、肿瘤免疫相关、DNA复制、转录/损伤修复、信号转导等多个方面的功能。实时荧光定量PCR验证4个基因表达的改变与芯片结果具有一致性。6. NC 6.25μM可抑制Topo I和Topo II介导的质粒DNA超螺旋的解旋,NC可下调肿瘤组织中Topo I、II蛋白表达。结论1. NC具有明显的体内、外抗肿瘤作用。2 NC抗肿瘤作用的机理可能是:①阻滞细胞于G2/M期,诱导肿瘤细胞凋亡。②调控肿瘤相关基因的表达。③损伤DNA,造成DNA双链断裂,3. NC可抑制Topo I、II的催化活性,Topo可能是其细胞毒活性的靶点之一。