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研究背景和研究目的:成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)15/19是一个具有激素样作用的调节因子,可以调控胆汁酸、参与糖脂代谢,在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。人类FGF19基因编码的蛋白与小鼠FGF15基因编码的蛋白相似,FGF15可视为FGF19的同源基因。FGF15/19在远端小肠中大量表达,与其特异性的成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor 4,FGFR4)和共同受体β-klotho结合,通过激活Wnt/β-catenin信号,进一步上调cyclin D1的表达,最终引起肿瘤细胞的增殖和生长。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是临床常见的恶性肿瘤之一,是癌症相关死亡增长最快的原因,治疗效果欠佳,亟需深入研究其发病机制。目前认为肿瘤微环境、肿瘤干细胞在肝癌的发生、发展中起着重要的作用。肝癌是一种代谢性的疾病,代谢改变与肿瘤发生、发展之间的关系已经明确,然而其影响肿瘤细胞发生、发展的机制仍不清晰。非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)和HCC之间存在相互联系。对这种疾病机制的更全面的理解对于早期诊断、治疗甚至预防都是至关重要的。我们尝试通过NASH-HCC模型探讨FGF15/19信号上调对肝癌的影响及机制。研究方法:用N-亚硝基二乙胺(nitrosodimethylamine,DEN)(untreated,UT)和(control diet,CD)高脂肪饮食(high fat diet,HFD)处理的雄性C57L/J小鼠建立了NASH-HCC模型。分别建立对照组UT+CD,高脂饮食组UT+HFD,肝癌低脂饮食组DEN+CD,肝癌高脂饮食组DEN+HFD,应用生化分析、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、Western blot、RT-PCR、免疫组化染色(immunohistochemical,IHC)、苏木和伊红(hematoxylin-and-eosin,HE)染色、免疫荧光染色、小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)和流式细胞术等方法,研究小鼠体内FGF15-FGFR4信号变化,炎症程度,脂代谢水平,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),以及研究Wnt/β-catenin信号通路等探讨其作用机制。使用游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)处理Hapal-6细胞(小鼠肝癌细胞系),H4IIE细胞(大鼠肝癌细胞系)和Hep G2细胞(人HCC细胞系)进行一系列研究。最后在NASH-HCC的人HCC肝癌标本中验证了体内实验和体外实验的结果。研究结果:(1)应用超声监测不同时间点的小鼠肝脏肿瘤发展情况。结果显示DEN+HFD小鼠显示出侵袭性肿瘤生长模式,大体解剖结果证实了超声检查结果。小鼠的肝脏组织HE染色及油红染色显示肿瘤高脂组小鼠中脂肪性肝炎和肝癌的特征,表明NASH-HCC模型的成功。肿瘤高脂组小鼠的体重、肝脏重量和甘油三酯(triglyceride,TG)水平显著增加,这意味着脂质代谢紊乱可能加速DEN诱导的致癌转化。高脂饮食组小鼠存在血糖代谢异常和胰岛素抵抗,且在肿瘤高脂组尤为明显。提示代谢紊乱与肿瘤相关。(2)NASH-HCC小鼠模型构建成功后,我们检测了FGF15的表达水平,结果显示,不管是血清、回肠还是肝组织中FGF15的表达,与其他组相比,在肿瘤高脂组小鼠中FGF15水平显著增加。(3)我们用IHC、Western blot测定,结果显示实验组(单纯高脂组,肿瘤对照组和肿瘤高脂组)中FGFR4、β-klotho和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)的表达显著增加,提示肝癌、高脂环境可促使FGFR4、β-klotho表达增加,FGF15信号传导与肝癌致癌转化过程中的异常脂质合成有关。(4)肝癌通过侵袭性特征表达干细胞标志物。因为上皮细胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)和CD133是肝癌中被广泛接受的表面标志物,我们进一步分析了Ep CAM和CD133的表达,以研究它们在NASH-HCC小鼠的肝癌致癌转化过程中的潜在作用。结果表明,肿瘤高脂组小鼠的Ep CAM阳性细胞数量明显增多。β-catenin是Wnt通路中的关键成分,与Ep CAM相关。我们进一步分析了β-catenin的蛋白表达水平,结果显示β-catenin不仅在肿瘤组小鼠中显著增加,而且在单纯高脂组小鼠的肝组织中亦有增加,这些结果表明,肝脏脂质代谢可能在影响Ep CAM和Wnt/β-catenin信号传导介导的癌变过程中起着重要作用。上述结果进一步在体外实验中验证,这些数据支持了FGF15信号通过促进EMT,从而导致肝癌的发生、发展。(5)阻断FGFR4可消除FFA促进的迁移能力和异常信号传导。通过FFA处理后,Hepal-6细胞的迁移能力显著增加。使用抑制剂后,Hepal-6细胞的迁移能力被阻断。FGFR4的抑制显著降低了FFA诱导的Ep CAM、β-catenin和Cyclin D1表达。为了研究沉默FFA信号关键基因是否会影响这些下游分子事件,使用si PPAR-α和si CD36处理Hapal-6细胞,然后再将上述细胞用FFA处理。结果显示,PPAR-α和CD36的si RNA敲除显著降低了由FFA诱导增加的Ep CAM、β-catenin和Cyclin D1表达,FFA和FGF15/19-FGFR4信号传导之间的相互作用在促进肿瘤起始和肝癌发展中起着关键作用。(6)人NASH-HCC中存在FGF19异常信号传导。IHC三重染色测定结果显示FGF19/FGFR4/β-klotho均大量表达且同时分布在肝癌组织中。与邻近的良性组织相比,在肝癌组织中也观察到显著增加的Ep CAM表达。NASH-HCC患者的肿瘤较良性组织中FGFR4,FASN,AFP和β-catenin的表达显著上调。研究结论:(1)高脂环境下FGF15/19与FGFR4、β-klotho表达上调,共同激活下游信号传导,在肝癌的发生、发展过程中起着关键作用。(2)肝脏脂质代谢可能在影响Ep CAM和Wnt/β-catenin信号传导介导的癌变过程中起着重要作用。(3)阻断FGFR4可消除游离脂肪酸促进的肿瘤迁移能力和异常信号传导,是潜在的治疗靶点。进一步研究高脂环境下FGF15/19信号传导对了解肝癌发病机制具有重要意义。