食管癌是最常见和死亡率最高的癌症之一。目前,早期诊断和治疗食管癌的临床方法仍然十分有限,因此食管癌的五年生存率仅为15-20%。食管上皮癌变的发生经历了从增生到不典型增生,到原位癌和食管癌的多阶段发展过程。食管癌前病变具有双向不稳定性的发展特点:它可以迅速发展成癌症,或者在一个阶段保持多年不变,甚至恢复为正常组织。亚硝胺类化合物及其前体与人类食管癌的发生密切相关,并且也可诱导动物食管癌的发生。因此甲基苄基亚硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine,NMBA)诱导的大鼠食管癌变模型已被视为研究食管癌发生的分子机制,进行化学预防和治疗的成熟动物模型。生长因子和生长因子受体介导的信号通路在正常食管细胞的转化过程中发挥重要作用。Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/AKT/mTOR信号通路调节细胞增殖,分化和细胞代谢,当该信号通路被异常激活时,可以促进肿瘤生长和细胞存活。据报道激活的Extracellular signal-regulated kinase(ERK)1/2参与细胞增殖,分化和迁移。Mitogen-activated protein kinase(MAPK)通路激活的激酶可以通过激活蛋白1(Activator protein 1,AP-1)转录因子增强环氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)转录。多研究表明,近20%的人类癌症与慢性炎症有关。COX和脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)途径的过度活化导致花生四烯酸代谢异常,这可能是炎症诱发癌变的原因之一。COX-2代谢产生的前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)可通过调节细胞增殖,迁移和凋亡的信号通路来促进癌症进展。除此之外,Pentraxin相关蛋白PTX3是体液免疫的重要组成部分。PTX3缺乏促进补体依赖性炎症,可诱导上皮癌变。化学预防已被认为是预防食管癌的有效策略之一。异鼠李醇(Quercetin-3-methyl ether,Q3ME)是在多种药用植物中发现的槲皮素衍生物。据报道,Q3ME可以通过抑制ERKs活性进而抑制上皮细胞癌变。Q3ME还可抑制拉帕替尼敏感和耐药的乳腺癌细胞的生长。然而,关于Q3ME对食管癌变的作用及其机制研究尚无报道。在该研究中,我们通过三部分研究异鼠李醇在食管癌中的作用及其机制。首先通过免疫组化染色方法及Western Blot方法证明AKT和ERKs在食管癌中的磷酸化表达上调,通过超级计算机筛选,下拉实验及激酶芯片实验找到靶向抑制剂异鼠李醇;在体外通过增殖实验和克隆形成实验证实Q3ME可抑制食管癌细胞的增殖和锚定非依赖的生长,通过Western Blot方法及荧光素酶试验方法证实Q3ME可能通过抑制AKT/mTOR/p70s6k和MAPK/ERKs信号通路的过度激活进而抑制食管癌变过程;进一步通过体内实验验证Q3ME可以抑制NMBA诱导的大鼠食管癌前病变的发生,并且利用免疫组化方法及酶联免疫吸附试验方法证实Q3ME通过靶向作用于AKT和ERKs,抑制其下游信号通路的激活。第一部分p-AKT和p-ERKs在人食管鳞癌中的表达及发现其抑制剂Q3ME第一章p-AKT和p-ERKs在人食管鳞癌组织中以及人食管癌细胞中的表达方法1、以食管癌旁正常组织作为对照,利用免疫组织化学方法检测食管癌组织芯片中p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)的蛋白表达情况。2、以人食管来源的永生化细胞SHEE作为对照,利用Western Blot方法检测人食管鳞癌细胞中p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)的表达情况。结果1、在和食管癌旁正常组织进行对比,p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)在食管癌组织中呈现磷酸化水平上调。免疫组化染色结果显示:通过对25例食管癌组织芯片中配对食管癌和癌旁组织的比较,p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)在食管癌组织中显示磷酸化水平上调,而在食管癌旁正常组织则呈现低表达或未表达,并且p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)在食管癌组织中表达差异具有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01)。这提示p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)可能在食管癌的发生中发挥一定作用。2、与正常食管来源永生化细胞SHEE相比,p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)在食管癌细胞中显示磷酸化水平升高。Western blot结果显示:通过和人食管来源的永生化细胞SHEE相比,p-AKT(Ser473)和p-ERKs(Thr202/Tyr204)在检测的不同食管鳞癌细胞中均显示磷酸化水平升高,而AKT和ERKs总蛋白在SHEE细胞和食管鳞癌细胞中的表达并无明显差异。第二章Q3ME体外结合AKT和ERKs并抑制相关通路蛋白方法1、利用超级计算机技术筛选并模拟Q3ME与靶蛋白AKT和ERKs的相互作用。2、利用下拉实验证实Q3ME和AKT和ERKs的结合。3、利用蛋白激酶芯片检测Q3ME对细胞内信号通路的影响结果1、Q3ME分别与AKT和ERKs蛋白激酶的ATP结合结构域结合。超级计算机模拟实验结果显示:Q3ME与AKT1/2或者ERK1/2的ATP结合口袋之间存在相互作用,并且能与该结构域结合形成复合物。2、Q3ME可与AKT和ERKs蛋白在细胞水平相互结合。蛋白下拉实验结果显示:Q3ME能分别与AKT和ERKs相结合。3、蛋白激酶芯片检测Q3ME对信号通路的作用。芯片结果显示:和对照组相比,加入NMBA处理可以诱导c-Jun,p70S6k,RSK2等蛋白的磷酸化激活,而Q3ME可以抑制c-Jun,p70S6k,RSK2的磷酸化激活。此结果说明Q3ME可以靶向作用于AKT和ERKs,从而对下游信号通路的活化发挥抑制作用。第二部分Q3ME抑制食管癌细胞增殖及其分子机制的研究第一章Q3ME通过靶点介导抑制食管癌细胞锚定非依赖生长及细胞增殖方法1、合成AKT和ERKs靶向抑制剂Q3ME。2、利用MTS方法检测Q3ME对人食管永生化细胞SHEE的活力的影响。3、利用克隆形成实验检测Q3ME对EGF诱导的SHEE细胞锚定非依赖生长性的影响以及Q3ME对食管癌细胞的锚定非依赖生长性的影响。4、利用MTS方法检测Q3ME对食管癌细胞增殖作用的影响。结果1、合成了可以同时结合AKT和ERK的ATP结构域并抑制其激酶活性的化合物Q3ME。2、Q3ME对SHEE细胞活力度无明显的影响。MTS结果显示:利用不同浓度的Q3ME处理人食管来源的永生化细胞SHEE 24 h或者48 h,10μM以下浓度处理的细胞和DMSO处理组相比细胞存活率在80%以上,提示小于此浓度的化合物对SHEE细胞活力度没有明显影响并可用于后续实验。3、Q3ME可以抑制食管癌细胞的锚定非依赖性生长。克隆形成实验显示:人食管癌永生化细胞SHEE在EGF诱导下具有恶性转化能力,而Q3ME能够抑制该转化能力,并且呈剂量依赖性。同时Q3ME可以抑制食管癌细胞KYSE450和KYSE510的克隆形成能力,抑制效果和剂量呈正相关。4、Q3ME显著抑制食管癌细胞的增殖。MTS结果显示:不同剂量的Q3ME处理食管癌细胞KYSE450、KYSE510后,可显著抑制食管癌细胞的增殖能力。48 h和72 h的结果均显示统计学差异。第二章Q3ME抑制细胞增殖及克隆形成的机制方法1、利用Western Blot方法检测Q3ME对信号通路的影响。2、利用荧光素酶实验检测Q3ME对AP-1转录活性的作用。结果1、Q3ME抑制食管癌细胞系中AKT和ERKs下游信号通路的激活。Western Blot结果显示:Q3ME抑制食管癌细胞KYSE450和KYSE510中mTOR,p70S6k和c-Jun的磷酸化水平。2、Q3ME抑制食管癌细胞中AP-1转录活性。荧光素酶实验结果显示:食管癌细胞KYSE450和KYSE510 AP-1的转录活性增强,而Q3ME可抑制食管癌细胞中AP-1的转录活性,抑制作用和Q3ME的剂量呈正相关。第三部分Q3ME对大鼠食管癌变的抑制作用及其机制研究第一章构建NMBA诱导大鼠食管癌前病变模型并检测Q3ME效果方法1、利用NMBA诱导大鼠形成食管癌前病变模型。2、通过H&E染色结果进行癌前病变分类统计,判断Q3ME的效果。结果1、NMBA诱导Fisher 344(F344)大鼠食管癌前病变模型。动物实验结果证明:通过NMBA 35 W的诱导,F344大鼠食管上皮形成了增生,轻度不典型增生,中度不典型增生以及重度不典型增生的癌前病变。2、Q3ME抑制F344大鼠食管癌前病变的形成。NMBA诱导组引起大鼠产生不同类型的癌前病变,Q3ME处理组和NMBA组相比,Q3ME低剂量和高剂量均显著抑制大鼠食管上皮增生,轻度不典型增生,中度不典型增生和重度不典型增生病变的形成。并且高剂量Q3ME的效果优于阳性对照增生平处理组。第二章Q3ME抑制大鼠食管癌变的机制研究方法1、免疫组织化学方法检测大鼠食管癌前病变组织中增殖相关指标和炎症指标的表达水平。2、酶联免疫吸附试验方法检测大鼠血清中COX-2和PTX3的表达。结果1、Q3ME抑制增殖相关指标Ki-67,c-Jun,p70S6k的表达并抑制炎症相关指标NF-κB,COX-2和CD11B的表达。免疫组化结果显示:NMBA组大鼠由NMBA诱导35 W后,其食管上皮组织中Ki-67,c-Jun,p70S6k的表达和正常大鼠食管上皮相比明显升高,Q3ME显著抑制Ki-67,c-Jun,p70S6k的表达;NMBA诱导可以引起大鼠食管上皮中NF-κB,COX-2和CD11B的表达增强,Q3ME也显著抑制炎症指标NF-κB,COX-2和CD11B的表达。此结果进一步说明Q3ME抑制食管癌前病变与抑制增殖和炎症相关。2、Q3ME抑制大鼠血清中COX-2的表达,上调PTX3的表达。酶联免疫吸附试验结果显示:Q3ME处理组和NMBA组相比,高剂量Q3ME显著抑制大鼠血清中COX-2的表达,增加大鼠血清中PTX3的含量。ELISA结果进一步证实Q3ME可以通过调节体内炎症之间的动态平衡发挥抑制食管癌的作用。结论1、Q3ME靶向作用于AKT和ERKs并抑制下游信号通路相关蛋白的磷酸化激活,最终抑制食管癌细胞的增殖和转化。2、Q3ME抑制由NMBA诱导产生的大鼠食管癌变,该抑制作用可能通过作用于AKT和ERKs信号通路,从而抑制细胞的增殖,并调节炎症实现的。Q3ME有望成为食管癌预防和治疗的靶向药物。