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水稻抽穗期是一个重要的性状农艺,其决定了品种的地域分布和产量。因此,水稻抽穗期基因的分离和克隆对作物遗传改良具有重要的价值和现实意义。在本研究中,我们发现长日照成花素RFT1通过14-3-3蛋白与磷酸化的Os FD1结合形成成花素激活复合物(florigen activation complex,FAC);鉴定了一个CIPK蛋白激酶基因Phosphorylation Modifier of Os FD1(PMF1),PMF1与Os FD1直接互作并磷酸化修饰Os FD1。在长日照条件下,PMF1影响Os MADS14/15/18/34基因表达并调控水稻成花转换。主要的研究结果如下:1、RFT1/14-3-3/Os FD1复合物聚集在细胞核内需要磷酸化的Os FD1。运用体外pull-down和体内双分子荧光互补(Bi FC)实验都证明长日照成花素RFT1与14-3-3蛋白相互作用。体外磷酸酶处理和pull-down实验揭示14-3-3蛋白(Gf14c)与磷酸化的Os FD1互作,与去磷酸化的Os FD1不互作。此外,体内Bi FC和亚细胞定位组合实验证明,磷酸化的Os FD1与RFT1/14-3-3复合体互作形成FAC并定位在在细胞核内。2、Os FD1正调控促进水稻抽穗期。利用Crispr-cas9系统创建了crispr-osfd1材料。与对照品种中花11号(ZH11)相比,crispr-osfd1在武汉自然长日照条件下推迟开花17天,在短日照条件下晚开花9天。同时,我们创建了Os FD1超量表达植株Os FD1-OE和Os FD1(S192A)超量表达植株Os FD1(S192A)-OE。在长日照条件下,Os FD1-OE植株比对照品种中花11号(ZH11)提早8天抽穗,而Os FD1(S192A)-OE植株抽穗期与野生型相似。推测Os FD1促进水稻抽穗的功能需要磷酸化S192残基。3、PMF1在细胞核内与Os FD1直接互作。通过酵母双杂交实验鉴定了一个与Os FD1互作的蛋白激酶基因PMF1(LOC＿07g48760),PMF1的N端(aa 1-313)与Os FD1的C端(aa 124-195)直接互作。通过pull-down和Bi FC实验进一步佐证了PMF1和Os FD1之间的互作关系。亚细胞定位结果表明PMF1和Os FD1蛋白共定位在细胞核内。Bi FC显示了PMF1与Os FD1互作的CFP荧光在水稻原生质体的细胞核内。因此,PMF1与Os FD1在细胞核内互作。4、PMF1在长日照条件下调控水稻抽穗期,也影响穗颖花数和穗枝梗数。鉴定了PMF1基因的Tos17插入突变体pmf1。pmf1植株在长日照条件下比野生型植株晚抽穗20天,在短日照条件下与野生型的抽穗期基本一致。考察其它农艺性状发现,在长日照条件下,pmf1比野生型植株的穗更大(穗枝梗数和穗颖花数增多)。遗传互补实验证实PMF1基因可以恢复pmf1突变体的晚抽穗表型。5、蛋白激酶PMF1磷酸化修饰Os FD1。体外激酶实验表明PMF1蛋白具有激酶活性,且能自磷酸化修饰。PMF1磷酸化修饰Os FD1蛋白的192位丝氨酸残基(S192)。体内免疫沉淀分析表明:在长日照条件下pmf1植株中的磷酸化Os FD1蛋白量野生型相比明显减少。这些结果表明,在长日照条件下PMF1介导了Os FD1的S192残基的磷酸化。6、PMF1通过FAC调控Os MAD14/15/18/34基因表达。在长日照和短日照条件下,我们分别检测了pmf1和crispr-osfd1植株茎尖组织中Os MADS14/15/18/34基因的表达水平。与ZH11相比,pmf1和crispr-osfd1植株中Os MADS14/15/18/34基因在长日照条件下表达显著降低,在短日照条件下表达没有明显变化。此外,与ZH11植物相比,OSMAD14/15/18/34基因在Os FD1-OE植株的表达量显著增加,在Os FD1(S192A)-OE植株的表达丰度几乎不变。因此,PMF1在长日照条件下调节Os MADS14/15/18/34基因表达。7、PMF1影响Ghd7和Hd1表达。基因昼夜表达节律分析表明,PMF1在长日照和短日照的白天都表现出一个表达低谷,但长日照的表达量明显高于短日照。此外,长日照条件下,在pmf1植株中,开花抑制子Ghd7和Hd1表达升高,开花激活子Ehd1和RFT1表达降低。酵母双杂交实验证明PMF1不与Ghd7、Hd1和Ehd1互作。因此,PMF1还可能通过Ghd7或Hd1途径影响水稻长日照条件下的抽穗期。综上所述,我们揭示了水稻成花素RFT1形成FAC的分子模型。RFT1通过与细胞质中的Gf14c相互作用,形成RFT1/Gf14c复合物进入细胞核与磷酸化的Os FD1结合形成FAC。我们鉴定了一个蛋白激酶基因PMF1,其突变体在长日照条件下推迟抽穗,在短日照条件下正常抽穗。PMF1与Os FD1互作并磷酸化Os FD1。因此,我们认为在长日照条件下,PMF1磷酸化修饰Os FD1蛋白是FAC核积累并起始水稻开花所必需的。