脂肪组织是人体重要的能量贮存器官。当能量摄取大于消耗时,就产生肥胖,导致脂肪组织体积增大。脂肪组织体积的增大,一方面是由于脂肪细胞数目的增多；另一方面是由于脂肪细胞体积的增大。脂肪细胞起源于血管基质中多潜能干细胞,这类干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,在合适的条件下,可以分化为脂肪细胞、肌肉细胞、软骨细胞和成骨细胞等中胚层来源的细胞。从多潜能干细胞发育为成熟脂肪细胞需要经历一系列精确调控的级联过程,主要可以被划分为两个阶段：多潜能干细胞定向为前脂肪细胞；前脂肪细胞终末分化为成熟的脂肪细胞。之前的研究主要集中于从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化过程,对于多潜能干细胞定向成前脂肪细胞涉及的机制尚未研究清楚。Tang等的研究建立了研究多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的良好模型。研究表明,C3H10T1/2多潜能干细胞,经过6天10ng/ml骨形成蛋白4(BMP4)诱导可定向成前脂肪细胞,而后经过经典的MDI (0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Mix),1μM地塞米松(Dex),1μg/ml胰岛素(Insulin))分化诱导剂作用,进一步分化成成熟的脂肪细胞。C3H10T1/2多潜能干细胞定向成前脂肪细胞,主要是通过BMP4与BMPR1A受体结合,激活Smad和p38信号通路从而导致多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1, low density lipoprotein receptor-related protein1)是低密度脂蛋白受体家族的成员,在脂蛋白代谢、蛋白酶降解等多种生物过程中发挥重要作用。Lrpl的功能来源于它的三个重要特征：1它可以识别30多种不同的配体；2它能够与大量的胞内蛋白结合,通过磷酸化形式传递信号；3它能够结合并调节其他的膜内受体功能。整体水平敲除Lip1基因的小鼠致死,显示出其在胚胎发育过程中的重要作用。组织特异性敲除Lrp1基因,显示其在血管,中枢神经组织,巨噬细胞,肝脏等发育过程中发挥重要作用。脂肪组织中特异性敲除Lrp1的小鼠体重减少,脂肪组织体积减小,说明Lrp1对于成脂有重要作用。然而,Lrpl是否可以影响成脂定向从而改变多潜能干细胞定向命运尚不清楚。因此,本文通过C3H10T1/2多潜能干细胞,在定向期和脂滴成熟期分别敲低Lrp1,研究此基因在成脂定向中的作用,并初步探索其影响成脂定向的机制。本文采用小干扰RNA技术(RNAi),在体外水平研究低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)对C3H10T1/2多潜能干细胞成脂的作用。在C3H10T1/2成脂的定向期敲低Lrp1,通过镜下观察,油红O染色,Western blotting等实验证实定向期敲低Lrp1显著抑制C3H10T1/2多潜能干细胞成脂。在C3H10T1/2脂滴成熟期敲低Lrp1,通过油红O染色,Western blotting等实验证实脂滴成熟期敲低Lrp1无法抑制C3H10T1/2多潜能干细胞成脂。由上可知敲低Lrp1抑制成脂的作用,主要发生在C3H10T1/2成脂的定向期。Huang等研究表明,BMP4可以激活下游Smad1/5/8信号通路从而发挥促进C3H10T1/2多潜能干细胞成脂的作用。敲低Smad信号通路抑制C3H10T1/2多潜能干细胞成脂,那么敲低Lrp1是否通过抑制此信号通路抑制成脂呢?本文在Control RNAi和Lrp1RNAi的C3H10T1/2细胞系中检测加入BMP4后1’,5’,10’,30’下游的Smad1/5/8信号通路激活情况,发现敲低Lrp1显著抑制BMP4诱导的Smad1/5/8磷酸化。这些结果说明敲低Lrp1通过下调Smad信号通路,抑制BMP4诱导的C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向。肥胖是指人体脂肪的过量储存,脂肪组织增大。肥胖的产生一方面是由于脂肪细胞数目增多；另一方面是由于单个脂肪细胞体积增大。脂肪,骨,软骨细胞都来自于相同的前体干细胞。成脂开始于胚胎期,并在整个生命过程中持续发生这一过程由大量的环境因子调节,并伴随着细胞形态与基因表达的变化。首先间充质干细胞增殖并定向成前脂肪细胞,而后成纤维型的前脂肪细胞终末分化成圆球形的脂肪细胞。大量的研究表明干细胞命运可以通过控制他们的形状及细胞和胞外基质组分(ECM)相互粘连状态而人工改变。纤维连接蛋白(Fibronectin)是细胞外基质组分(ECM)的主要组成成分,它可以与包括胶原蛋白,纤维蛋白原和核心蛋白聚糖在内的多种ECM组分的N末端结合。因此Fibronectin被认为是ECM生物合成的主要调节成分。Fibronectin与细胞表面受体整联蛋白(Integrin)相互作用。Integrin介导进出细胞的信号传导,组织细胞骨架及传递由于细胞外基质组分相互作用产生的信号。Integrin是二聚体跨膜蛋白,由一个α亚基和一个β亚基组成,将细胞骨架与ECM连接在一起。其中Integrin a5是由Itga5基因编码的,属于Integrin a链家族。Integrin a5链胞外区域经历转录后切割产生二硫键连接的重链和轻链与Integrin β1链结合构成Fibronectin受体。敲除Fibronectin或Itga5的小鼠由于中胚层的发育缺陷导致胚胎期死亡,说明Fibronectin和Itga5在中胚层发育过程中发挥重要作用。Itga5(Integrinα5)对中胚层发育作用重大,而其对中胚层来源的脂肪细胞发育的作用研究尚且不足,对脂肪细胞定向作用尚无报道。本课题使用C3H10T1/2多潜能干细胞系研究Itga5对多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的作用。C3H10T1/2多潜能干细胞系来自17天的C3H小鼠胚胎中胚层,其功能上类似于间充质干细胞,是研究中胚层发育的良好模型,它具有多种分化潜能,在-定诱导条件下可以定向分化为肌肉,骨骼,软骨,脂肪细胞。Tang等的研究表明10ng/ml的BMP4可以促进C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,而后经过经典的MDI诱导,进一步分化为成熟的脂肪细胞。我们的研究发现,Itga5在C3H10T1/2多潜能干细胞定向期高表达,而在脂滴成熟期表达量很低。那么定向期Itga5高表达对于C3H10T1/2多潜能干细胞成脂是否必需呢。于是,我们设计了Itga5基因的小干扰RNA,在C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向期敲低Itga5基因。结果显示,敲低Itga5基因可以显著抑制C3H10T1/2多潜能干细胞定向成脂。可见Itga5对于C3H10T1/2多潜能干细胞定向成脂是必须的。Rac1是RhoGTP酶家族成员,他可以促进细胞膜褶状,导致边缘扩张和细胞蔓延。已有的研究表明,Itga5可以调节激活型Rac1表达,并且在3T3-L1前脂肪细胞系中Itga5表达谱与激活型Rac1表达谱相同。那么在C3H10T1/2细胞系中Itga5是否是通过Rac1发挥作用的呢。为此,本文构建了持续激活型Rac1(Ca-Rac1)质粒,在C3H10T1/2中过表达Ca-Rac1。本文的研究发现,在C3H10T1/2多潜能干细胞中过表达Ca-Rac1促进其成脂。另外,过表达Ca-Rac1可以回复敲低Itga5导致的抑制C3H10T1/2多潜能干细胞定向成脂的作用。说明Rac1很可能是Itga5信号通路的下游靶基因。