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b0,+是肠道和肾脏主要转运碱性氨基酸和胱氨酸的转运载体。它属于钠离子非依赖的异二聚体氨基酸转运载体,由b0,+AT和rBAT两个亚基组成,且两者需要一起表达才能到达浆膜上发挥氨基酸转运活性。b0,+AT由SLC7A9基因编码,此基因位于19号染色体上,并且,该蛋白对碱性氨基酸和胱氨酸有很高的亲和力,包括b0,+AT-1和其剪切体b0,+AT-2两种形式,两个序列都是编码相同的蛋白质。为研究鸡碱性氨基酸转运载体b0,+AT的cDNA结构特征,探讨该基因mRNA和蛋白的表达特点,本试验运用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术克隆得到鸡b0,+AT全序列,并对该序列进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR方法检测鸡21日龄b0,+AT mRNA的组织特异性分布,并选用1、21、42和63日龄黄羽肉鸡十二指肠、空肠、回肠组织样品,采用荧光定量PCR方法检测鸡b0,+AT mRNA发育性表达;通过构建鸡pET-32a-b0,+AT载体,原核表达蛋白经纯化后,注射于新西兰大白兔,经三次加强免疫后,制备兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,并采用ELISA和Western Blot技术分析其效价和特异性;采用Western Blot技术检测兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体在鸡肠道组织的特异性与应用。
研究结果如下:
1.利用RACE方法克隆得到一段1828bp的鸡b0,+AT基因全长cDNA序列(GenBank收录号为HQ338713),其中包括5’非翻译区(Untranslated Region,UTR)149bp,3’非翻译区197bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1482bp。
2.生物信息软件分析结果表明,鸡b0,+AT基因编码的蛋白序列为493个氨基酸,该基因与人、牛、鼠和猪在核酸序列上分别有77.08%、74.04%、77.08%和74.04%的同源性;在氨基酸序列上分别有69.61%、70.18%、69.64%、70.72%同源性。推测b0,+AT有12个跨膜螺旋结构。
3.实时荧光定量RT-PCR检测发现:b0,+AT mRNA在21日龄黄羽肉鸡各组织器官中广泛表达,其肠道表达量最高(十二指肠>回肠>空肠),肾脏和肺表达量次之,在肝脏、心、肌肉和脑也有少量的表达。
4.实时荧光定量RT-PCR检测鸡b0,+AT在1、21、42和63日龄黄羽肉鸡十二指肠、空肠和回肠的发育性表达模式,结果表明:b0,+AT mRNA发育性表达在十二指肠、空肠和回肠存在相似的规律;即从1d时b0,+AT表达达到较高水平后开始下降,到21d达到最低后开始上升,而42d后又下降。十二指肠和回肠均以1d和42d表达最高,显著高于其他两个阶段P>0.05);空肠以21d表达最低,且显著低于其他三个阶段(P<0.05)。
5.构建鸡pET-32a(+)-b0,+AT载体,经原核表达蛋白并纯化后,注射于新西兰大白兔,经过三次加强免疫后获得兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot技术检测制备的多克隆抗体效价和特异性表明,效价可达到1:204800,且特异性较好。
6.利用制备的兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体作为一抗,肠道组织膜蛋白为抗原,采用Western blot验证其在肠道粘膜组织中的特异性,结果表明在50kDa处有预期的特异性条带,且无其他杂带,表明抗体特异性很好,一抗稀释比例为1:4000。