目的和意义：α-酮戊二酸（盐）受体1（Oxoglutarate Receptor1, OXGR1）曾是多年来引人关注的孤儿GPCR（orphan G protein-coupled receptor, oGPCR）之一。2004年，α-酮戊二酸盐（Alpha-Ketoglutarate,AKG）被确认为OXGR1的内源性配基，而且该受体在肾小管中高表达。迄今为止，尚无有关OXGR1生理功能和病理意义的研究报道。糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是影响人类健康的第三严重疾病；糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最严重的并发症之一，也是终末期肾病主要原因。传统观点认为，肾小球及血管的改变在DN的病理生理学中起着重要作用，而往往忽视高血糖也可对肾脏的肾小管系统造成原发性损伤。新的观点认为，肾小管在DN及糖尿病中的作用，并非是一种继发性表现，而是具有其特有的作用机制，并且在病变早期就起作用。在糖尿病发展过程中，肾小球与肾小管之间存在着相互作用：一方面肾小球滤过率对肾小管产生影响，该作用称为球管平衡；另一方面存在着肾小管-肾小球反馈系统，起着稳定和交互性调节的作用。因此，有关肾小管病变在DN发病中重要作用的研究备受关注。基于肾小管在DN中的重要作用以及OXGR1在肾小管中高表达，而且AKG是糖代谢的重要中间产物，研究OXGR1在DN中作用，可为探索DN的损伤机制提供新的思路，对糖尿病及DN的防治具有重要的理论和现实意义，这正是本研究工作的新意所在。OXGR1在肾肿瘤的表达也值得探索。全氟烷酸类化合物(perfluoroalkyl acids, PFAAs)是指所有碳原子上的氢原子均被氟原子取代的一类化合物，其典型代表为全氟辛酸（Perfluorooctanoic acid,PFOA），它也是其它多种全氟化合物的重要前体之一。PFAAs广泛存在于人类的生活环境中，具有生物蓄积性并对人体有害。新近的研究证实，血浆中的PFOA及PFOS水平与高尿酸血症、慢性肾病具有相关性，但其机制尚未明确。另外，该类化合物的代谢存在种属差异，有人推测这是与肾小管上皮细胞的膜蛋白表达差异有关。材料和方法：1、体外原代培养大鼠肾小管上皮细胞的相关研究：（1）采用雄性Wistar大鼠20只，无菌取双肾，剪取薄层肾皮质，至1mm3大小。以2g/L的Ⅰ型胶原酶消化，经80目和170目细胞筛过滤，短时培养后更换培养瓶。使用添加胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS）营养添加剂的DMEM/F12培养液进行原代大鼠肾小管上皮细胞培养。（2）在96孔板中接种原代大鼠肾小管上皮细胞，在HBSS分别添加10或40μMAKG，同时设溶剂对照组（0μMAKG），孵育20min后吸除HBSS，测量每孔的荧光强度，观察其对不同浓度(1、2或4μM)的荧光素（Fluorescein, FL）吸收能力的影响。（3）将原代大鼠肾小管上皮细胞接种于Transwell小室中，在小室下部分别加入含1μM FL的PBS或含1μM FL及50μM AKG的PBS，在小室上部加入PBS，孵育5min后测量小室上部PBS的荧光强度，观察不同浓度的AKG对Transwell小室下部1μM FL转运的影响。（4）将大鼠肾小管悬液分别加入含1μM FL的孵育液或含1μM FL及50μMAKG的孵育液，孵育饱和后清洗、涂片，观察录像，测量荧光强度并对比。2、体内糖尿病模型的有关研究：将大鼠按65mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ毁损胰岛制成糖尿病模型。于16W及32W取大鼠肾脏，制成蜡块、切片、HE染色，显微镜下观察病理变化。免疫组化染色观察Vimentin在DM肾脏表达的变化。免疫荧光标记观察OXGR1及Vimentin在DM肾脏表达变化及两者之间的关系。3、体外培养人源肾小管细胞系HK-2的相关研究：在6孔板中接种HK-2细胞，分别加入含0、5、15或30mM葡萄糖的1640培养液，72h后提取总mRNA，反转录为cDNA，PCR扩增后进行凝胶电泳，比较相对表达量。4、AKG和全氟烷酸协同作用于HK-2细胞的研究：将HK-2细胞接种于六孔板，观察不同浓度PFOA对HK-2细胞OXGR1mRNA表达的影响。应用MTT法，检测300μM PFOA和不同浓度的AKG对HK-2细胞活性的影响。应用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，检测300μMPFOA和不同浓度的AKG对HK-2细胞凋亡的影响。5、免疫组化方法标记OXGR1在原发肾脏肿瘤组织芯片中的表达，观察OXGR1在不同类型肾脏肿瘤之间的表达差异。实验结果：（1）优化的大鼠肾小管上皮细胞原代培养方法有效。添加ITS营养辅助剂可使原代细胞的传代7~9代，而缺乏ITS可导致原代细胞在传代后出现凋亡。（2）原代培养的肾小管上皮细胞具有吸收有机阴离子荧光素（FL）的能力。AKG（10或40μM）可明显促进细胞对FL（2或4μM）的吸收（P<0.05）；但当FL的浓度为1μM时，仅40μM AKG可明显促进FL的吸收（P<0.05）。（3）Transwell小室转运实验结果：与0μMAKG的对照组相比，50μMAKG对肾小管上皮细胞将FL转运至Transwell小室上部有更明显的促进作用（P<0.05）。（4）原代培养的肾小管细胞在FL饱和后可逐渐排出FL，与0μMAKG的对照组相比，50μMAKG组排出FL的速度明显加快，在8min及16min时有非常明显的差异（P<0.01），在24min时有明显差异（P<0.05）。（5）STZ注射大鼠成功诱发糖尿病，出现糖尿病肾病后，病理切片观察证实出现相应糖尿病肾病的病理表现，与新的国际糖尿病肾病病理分型标准相印证。在糖尿病肾脏改变中，炎症反应、间质纤维化以及肾小管萎缩等病变都以肾小管周围区域为著，而非以肾小球为中心，证实DM中肾小管病变具有独立性。免疫荧光标记证实OXGR1阳性区域主要位于肾小管的外缘区域，并在肾小管细胞之间也可见到阳性区域，这说明OXGR1主要位于肾小管细胞的底侧面表达。双重免疫荧光标记显示随着DM病程的加重，OXGR1阳性区域逐渐增强，同时Vimentin阳性区域逐渐增多，且OXGR1与Vimentin重叠的区域增多。肾小管上皮细胞Vimentin增多，提示肾小管出现了上皮-间充质转分化。肾小管上皮细胞的OXGR1表达增多，可能会导致肾小管的重吸收、转运功能出现障碍。（6）对照组培养液中不含葡萄糖，而含15mM或30mM葡萄糖培养液可明显增加HK-2细胞的OXGR1mRNA的表达（P<0.01），而含5mM葡萄糖培养液则与对照组无显著性差异（P>0.05）。（7）PFOA可上调HK-2细胞中OXGR1的mRNA表达。同时，AKG与PFOA协同作用可诱导HK-2细胞出现凋亡以及抑制其增殖活性（P<0.05）。（8）免疫组化标记证实， OXGR1蛋白表达在不同类型的肾脏肿瘤之间具有差异，肾母细胞瘤最弱，透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌较强，集合管癌最强；差异具有统计学意义（p<0.01）；但是透明细胞性肾细胞癌与乳头状肾细胞癌两组的OXGR1表达差异则没有统计学意义（p>0.05）。结论：本研究应用多种可行的体内、外模型，初步探索了OXGR1在肾小管上皮细胞中的生理功能及病理意义。（1）建立并优化了大鼠原代肾小管上皮细胞培养策略，为更加准确地模拟研究肾小管吸收、转运功能奠定了基础。（2）首次证实，生理浓度相当的α-酮戊二酸盐可影响原代大鼠肾小管上皮细胞有机阴离子的转运功能，主要表现为对离子转运速度的调节，即可明显提高有机阴离子的转运速度；α-酮戊二酸盐的这种功能可能通过其受体OXGR1起作用。（3）本研究建立的大鼠DN模型，与新的国际糖尿病肾病病理分型相印证。（4）首次通过体内、外模型证实，高糖可促进肾小管上皮细胞OXGR1的表达；随着DM病程的进展，肾小管上皮细胞EMT加重，且OXGR1高表达与EMT存在着一定的关系；OXGR1在DM发生发展中的作用可能是与其调节肾小管功能有关，通过影响有机阴离子转运来实现。（5）首次经细胞实验证实，PFOA可上调HK-2细胞中OXGR1的mRNA表达；而AKG与PFOA共同作用可抑制HK-2细胞的增殖活性及诱导细胞凋亡；这种作用可能通过OXGR1起作用。（6）OXGR1在不同类型的肾脏肿瘤中表达不同，可作为集合管癌的标志物，用于原发肾脏肿瘤的鉴别诊断。本研究有关OXGR1在肾小管功能方面的原创性探索，为进一步研究OXGR1与相关致病因子的关系，深化对肾脏疾病的理解，开发新的治疗手段，提供了基础和可能方向。