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非小细胞肺癌是发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤,严重危害人类健康,目前临床对于该症仍以化学治疗为主。然而,肿瘤耐药性的产生严重影响了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,是导致治疗失败的最主要原因之一。肿瘤的耐药机制错综复杂。现有研究认为,化疗药物在肿瘤细胞内的有效药物浓度不足,肿瘤内活性蛋白通过干扰药物作用机制而降低药物活性,肿瘤细胞自身的DNA修复功能及细胞凋亡相关因子的异常等是引起耐药的几个主要原因。目的:通过体外实验观察WWOX对肺腺癌细胞耐药性影响,初步探讨WWOX逆转肺腺癌细胞耐药性及其可能作用机制,为化疗耐药的研究寻找新的理论依据。方法:一、Western blot检测肺腺癌A549细胞WWOX蛋白表达。二、小剂量短时间紫杉醇作用法诱导A549,构建A549耐药细胞亚株(A549/T)。CCK-8法体外药物药敏实验检测A549/T对泰素和顺铂的IC50,计算耐药指数。Western blot检测WWOX蛋白表达情况。三、采用腺病毒包装系统AdMax重组复制缺陷型腺病毒Ad-WWOX。(一)采用PCR方法从质粒pIRES-EGFP上扩增序列IRES-EGFP,通过酶切、连接、筛选等步骤将序列IRES-EGFP插入质粒pDC316,构建质粒pDC316-IRES-EGFP。(二)采用PCR方法从质粒pINCY-WWOX上扩增WWOX片段,通过双酶切、连接、筛选等步骤将WWOX片段插入质粒pDC316-IRES-EGFP ,构建穿梭质粒pDC316-WWOX-IRES-EGFP。(三)质粒pDC316-IRES-EGFP和骨架质粒用Lipofectamin共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-WWOX-IRES-EGFP。PCR法鉴定后扩增、纯化。(四)感染Ad-WWOX-IRES-WWOX的A549/T细胞(T+)、感染Ad-IRES-EGFP的A54/T细胞(T-)和A549细胞(A-),三组细胞westen-blot检测WWOX表达。四、T+、T-和A+细胞分别经TAXOL、DDP作用72小时,采用CCK-8法检测细胞,计算细胞对药物的IC50值、耐药指数(resistance index,RI)和逆转倍数。五、T+、T-和A549/T细胞采用Hoechst染色方法检测细胞凋亡数。统计学处理:两组均数间比较采用t检验,多组均数间比较采用单因素方差分析,IC50值采用加权直线回归分析。结果:一、A549/T耐药株在含TAX100ng/ml的培养基中A549/T细胞生长良好。A549/T对泰素和顺铂的耐药指数分别为:22.43和14.18,耐药株对泰素高度耐药,对顺铂中等度耐药。二、重组复制缺陷型腺病毒Ad-WWOX穿梭质粒pDC316-WWOX-IRES-EGFP pDC316-WWOX-IRES-EGFP阳性克隆PCR扩增、DNA序列测定结果与Genbank中WWOX序列一致。Ad-WWOX毒种经PCR测定证实WWOX序列存在。Ad感染细胞24-48小时后,293细胞、T+、T-和A-组细胞观察到绿色荧光蛋白(EGFP)表达。三、WWOX的表达A549细胞、T-组和A-组无WWOX表达。T+细胞检测到WWOX表达。四、WWOX对A549紫杉醇耐药细胞耐药性的影响WWOX感染组T+细胞IC50较对照组组低(p<0.01)。WWOX对泰素和顺铂的逆转倍数分别为2.69和1.96,A549/T对泰素耐药指数从21.39下降至8.01,A549/T对顺铂耐药指数从13.99下降至7.15。五、WWOX对A549紫杉醇耐药细胞凋亡的影响Hoechst染色后荧光显微镜检测到呈蓝色的细胞核。正常细胞核呈正常的蓝色;凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色有些发白。24小时A549/T+组和A549/T-组凋亡率分别为6.1士0.4%和5.75士0.5%(p>0.05),48小时A549/T+组和A549/T-凋亡率分别为18士0.5%和5.86士0.4%(p<0.01),72小时A549/T+组和A549/T-凋亡率分别为35士0.8%和5.9士0.6%(p<0.01)。结论:一、异位表达WWOX的肺腺癌A549紫杉醇耐药株IC50下降明显,提示WWOX逆转肺腺癌耐药。二、WWOX显著诱导了肺腺癌A549紫杉醇耐药株的凋亡,并呈时间依赖性,提示WWOX逆转耐药的机制与凋亡有关。