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铜元素作为机体内必需的微量元素,是各种需铜酶的重要组成部分,然而铜也是最严重的环境污染源之一,尤其是在金属冶炼厂和铜矿开采区附近,铜污染最为严重,已经威胁到人类和动植物的生命健康,已经有很多研究报道铜在生殖系统及其他器官组织中的毒性作用,然而很少有系统地研究铜暴露对雄性生殖毒性作用的报道。因此,本试验旨在从体内和体外两方面探究铜对睾丸组织和GC-1精原细胞的损伤作用,从而对铜毒性在生精细胞损伤中的机制进行初步探究,以期系统地评价铜暴露对雄性生殖的毒性影响。体内试验:本试验采用灌胃无水硫酸铜的方法建立体内铜暴露模型,将60只CD-1成年雄性小鼠随机平均分成4组:对照组(Ctr,超纯水)、试验1组(Tes1,25 mg/kg/d)、试验2组(Tes2,100 mg/kg/d)和试验3组(Tes3,150 mg/kg/d),连续灌胃8周。通过测定血清和睾丸中铜含量,分析血清铜和睾丸铜之间的相关性。进行精子计数,分析精子活力。通过观察睾丸组织切片病理学上的变化,评价铜对睾丸组织的损伤程度。检测血清和/或睾丸中睾酮及睾酮合成相关酶的活性,评价铜对睾酮合成的影响。检测睾酮合成相关基因和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量,从基因水平评价铜对睾酮合成和睾丸细胞凋亡的影响,检测睾丸组织中Casp3蛋白的表达水平,从蛋白水平评价铜对睾丸细胞凋亡的影响。结果显示,血清中铜含量随着灌胃的铜剂量的升高而呈现极显著升高趋势(P<0.01),睾丸组织中铜含量仅仅在Tes3组中显著升高(P<0.05),经分析两组数据的协方差及其相关系数分别为2.73和0.81,提示血清铜和睾丸铜之间存在强的相关性。精子数量和精子活力均随着灌胃的铜剂量的升高而显著降低(P<0.05)。与Ctr组相比,较高铜剂量组睾丸组织严重损伤,主要表现为精原细胞和精母细胞减少,生精小管组织内出现空腔,甚至出现结缔组织填充现象。血清和睾丸中睾酮含量、睾丸中睾酮合成相关酶以及睾酮合成基因的表达量与Ctr组相比均无明显变化(P>0.05)。睾丸组织中较高浓度的铜显著提高了细胞凋亡基因Bax、Casp3的mRNA表达水平而降低了抗凋亡基因Bcl2的表达(P<0.05)。高铜显著提高了小鼠睾丸细胞中Casp3蛋白的表达量(P<0.05)。体外实验:为了研究铜暴露对雄性小鼠精原细胞的毒性影响,用含铜终浓度分别为10、50、100μM的培养液处理小鼠GC-1精原细胞,孵育24 h后,检测细胞内ROS、MDA、T-AOC、CAT、GSH、ATP的水平、线粒体膜电位的变化、细胞培养液上清中的LDH含量,免疫荧光染色法检测精原细胞的凋亡情况,运用荧光定量PCR技术检测细胞凋亡和自噬相关基因的mRNA表达水平。结果显示,与Ctr组相比,较高铜浓度处理的精原细胞内的ROS、MDA、T-AOC水平均有不同程度的升高(P<0.05),各试验组细胞培养液上清中的LDH含量均有所上升(P<0.05),而CAT和GSH的含量呈现先升高后降低趋势(P<0.05),线粒体膜电位和ATP水平均呈现显著降低趋势(P<0.05),凋亡细胞和死亡细胞数量随着灌胃的铜剂量的升高而上升(P<0.05),较高浓度的铜显著提高了细胞凋亡基因Bax、Casp8、Casp3和自噬基因Atg3、Atg5、p62、Lc3b的mRNA表达水平而降低了抗凋亡基因Bcl2的表达(P<0.05)。结论:由本试验可以得出,高铜会诱导睾丸组织发生损伤,影响精子发生过程,该影响的机制可能是高铜通过诱导精原细胞发生氧化应激,使精原细胞发生凋亡和自噬,从而影响雄性生殖。