目的: 瓣膜置换术是心脏瓣膜病的主要治疗方法。机械瓣术后需长期抗凝,血栓及出血等并发症发生率高;异种生物瓣术后不需长期抗凝,但易发生衰败及钙化;同种瓣寿命较长,毋需长期抗凝,但供体来源困难。组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heartvalve TEHV )避免了以往使用的人工心脏瓣膜可能具有的潜在并发症,是当前瓣膜外科研究的方向与热点。 随着 TEHV 研究的进展,研究人员发现静态构建的 TEHV,表面的内皮细胞粘附能力差,极容易脱落,特别是处于生理状态的流体条件下,细胞几乎脱落殆尽。所以Mayer 等提出“体外预调”的概念:既运用脉动生物反应系统在体外模仿体内心脏瓣膜的流体力学环境,在体外构建能够适应血流应力、功能完整的 TEHV。国外的 TEHV研究已取得一定的进展,在脉动应力条件下成功构建了 TEHV,但是国内的研究还处于起步阶段。由于国内目前尚无可以利用的脉动应力场可供使用,所以本研究首先设想构建能够模拟体内心脏瓣膜流体力学特征的环境:产生脉动应力流体的体外培养系统,并对其性能进行检测;利用这种脉动应力培养系统给体外静态构建的 TEHV 予脉动应力预适应处理,观察瓣叶表面内皮细胞粘附功能的变化,并从分子生物学角度对内皮细胞粘附功能变化的机制进行初步探讨。 方法: 1.体外脉动应力培养系统的构建 1)体外脉动应力培养系统包括培养部分和动力部分。培养部分是根据弹性膜泵的原理,采用聚碳酸酯、硅胶、玻璃材料构建而成,其核心装置脉动反应器由两部分组成:动力腔和流动腔。动力腔在下层,流动腔在上层,两腔之间用高弹力硅胶薄膜片隔开,膜片具有很好的弹性,依靠动力腔带动薄膜片产生搏动性液体,模拟体内血流脉动。流动腔远端开口处有特制瓣架可固定瓣膜,瓣架内径可调,以适应安装不同直径的瓣膜。脉动反应器通过单向阀门与储液瓶相连通,外接 5%CO2 和 95%空气的混合气体,以提供细胞生长所需要的外部环境。整个培养部分可置于恒温培养箱中。 2)动力部分是机控双相气泵,可周期性的将气体送入和抽出动力腔,带动硅胶薄膜片的上下波动,使流动腔内的液体周期性的从流入口进入,流出口流出而产生搏动性流动。 2<WP=7>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业2.体外脉动应力培养系统的性能检测1) 机械稳定性检测:利用普通生物瓣作试验瓣膜,连续运转 5 天,观察体外脉动应力培养系统机械稳定性。大体观察能否产生搏动性液体,瓣膜能否具有正常的开、闭功能; B 型超声检测生物瓣的工作状态,瓣叶的活动情况,瓣口的开放状态,有无返流;多普勒超声检测跨瓣压差、流速、积分面积等。2)抗污染性能检测:采用 LB 培养基作灌注液,连续运转 5 天,观察各部件之间有无液体渗漏,培养液有无混浊。光镜观察 LB 培养基有无细菌或霉菌污染,同时行营养琼脂培养基和霉菌琼脂培养基涂板试验。3) 流体力学性能检测:以在体犬主动脉瓣膜做对照,利用生物瓣做试验瓣膜检测脉动应力培养系统流体力学性能。观察其能够产生的最大流量、最大压力、极限剪切力的变化趋势,并与动物犬在体主动脉瓣膜作比较,观察两者是否具有相似性。4) 构建材料的体外细胞毒性试验:用构建脉动反应器、硅胶薄膜片、硅胶管道的材料浸提液与人脐静脉血管内皮细胞共培养,通过观察细胞形态学变化和细胞的相对增殖率(MTT 法检测)来判断材料的体外细胞毒性分级。以检测材料能否作为构建培养细胞的体外脉动应力培养系统而被安全合理的应用。3.体外脉动应力培养系统在 TEHV 构建中的初步应用1)采用胰酶、去污剂 Triton-X 100、核酸酶进行猪主动脉瓣膜的脱细胞处理,通过组织切片、电镜检查观察脱细胞效果。2)采用脱细胞猪主动脉瓣叶作支架,人脐静脉血管内皮细胞作种子细胞,体外静态构建 TEHV。于构建的第 4、7 天通过瓣叶上内皮细胞数、组织切片、电镜检查等观察内皮细胞的生长状态。3)体外脉动应力预适应对构建瓣膜内皮细胞粘附功能的影响实验随机分三组,每组 9 个瓣叶。静态对照组:静态构建的 TEHV,未经过流体作用;未应力预适应组:静态构建的 TEHV 未进行脉动应力预适应,直接给予高流量流体(600ml/min)冲刷 6 小时;脉动应力预适应组:静态构建的 TEHV 置入反应器内,循序渐进从小到大调节流量(40ml/min-450ml/min),脉动应力预适应培养 5 天,然后给予高流量流体(600ml/min)冲刷 6 小时。通过光镜计数、MTT 吸光度值、组织切片、电镜检查观察内皮细胞残留情况。 3<WP=8>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 4.TEHV 体外脉动应力预适应后内皮细胞粘附功能变化的机制探讨 将经过脉动应力预适应的 TEHV 内皮细胞消化收集后,采用 RT-PCR、Westernblot 等方法检测内皮细胞整合素 β1mRNA 和蛋白的表达,与静态组相比较,探讨内皮细胞粘附功能改变的可能机制。 结果: 1.根据设计参数,采用聚碳酸酯、硅胶材料成功构建脉动反应器、单向阀门的不同部件。脉动反应器是通过不锈钢螺丝将各部件固定形成的一个整体,用玻璃构建储液瓶,将各部件通过硅胶管和单?