论文部分内容阅读
目的:探索线粒体钙单向转运体（MCU）/calpain在心肌缺血再灌注损伤（I/R）中的作用及其在线粒体动态中的分子机制。方法:本研究采用6-8周龄雄性野生型（WT）C57BL6小鼠和同周龄C57BL6小鼠背景的过表达calpastatin小鼠（Tg-CAST）建立体内体外缺血再灌注模型,以及出生1-3天C57BL6小鼠乳鼠心肌细胞培养建立缺氧/复氧模型（H/R）,检测MCU/calpain与心肌损伤、线粒体分裂/融合的关系,及其各相关信号蛋白的表达。第一部分:缺血再灌注小鼠模型的构建和缺氧复氧细胞模型的构建体内模型构建是通过异氟烷诱导及维持麻醉,小鼠脱去心前区毛发,逐层分离心前区解剖结构,扩开4-5肋骨,轻轻挤出心脏,暴露左心耳,于左前降支走行区域进针,并做一个活结,关闭胸腔;0.5小时后松开活结,再灌注3小时后,取材。我们通过心电图观察QRS波和T波变化来确定模型是否构建成功。体外模型构建是通过剪取乳鼠心脏,使用II型胶原酶逐次消化心脏,获得心肌细胞,培养至同步搏动;将处理好的心肌细胞放于含有1%O2的培养盒中,培养箱中孵育12小时后,恢复氧供3小时,收集细胞。我们通过显微镜观察细胞状态确定是否构建成功。第二部分:心肌缺血再灌注时MCU/calpain上调,促进线粒体分裂和细胞凋亡首先建立野生型小鼠I/R模型,通过Western-blot确定线粒体MCU蛋白表达。确定时间点后,我们再次构建小鼠模型,给与MCU抑制剂Ru360干预,使用Evansblu-TTC染色法确定不同组小鼠的心脏损伤情况,采用Tunel法检测心肌组织凋亡,通过透射电镜观察组织心肌细胞线粒体形态。进一步,我们通过Western-blot检测凋亡相关蛋白以及线粒体动态相关蛋白,使用确定心肌损伤分子机制。细胞H/R模型中,我们给予Ru360抑制MCU功能,或spermine增强MCU功能,通过免疫荧光和western-blot检测MCU表达,我们通过流式凋亡检测、western-blot检测确定细胞凋亡,通过线粒体染色和western-blot检测确定线粒体形态和分裂/融合相关蛋白表达。第三部分Calpain通过Drp1和OPA1促进线粒体分裂和细胞凋亡建立野生型和Tg-CAST小鼠I/R模型,比较calpain活性变化,使用Evansblu-TTC染色法确定心肌损伤程度;通过透射电镜观察线粒体损伤情况。通过Western-blot检测凋亡相关蛋白以及线粒体动态相关蛋白。建立细胞H/R模型,给与calpain特异性抑制剂PD150606,通过流式凋亡检测、western-blot检测凋亡相关蛋白明确细胞凋亡水平,通过线粒体染色和western-blot检测确定线粒体动态和相关蛋白表达。结果:第一部分:缺血再灌注小鼠模型的构建和缺氧复氧细胞模型的构建通过心电图动态演变,明确心肌的缺血再灌注构建成功,该模型具有良好的稳定性和可靠性。在细胞模型中,通过观察细胞生长形态和搏动节律,确定缺氧复氧的过程构建成功。第二部分:心肌缺血再灌注时MCU/calpain上调,促进线粒体分裂和细胞凋亡MCU随心肌再灌注时间（或复氧时间）增加而表达升高,同时,MCU升高伴随着线粒体分裂和心肌细胞的凋亡,表现为线粒体分裂蛋白Drp1向线粒体转移增多,线粒体融合蛋白OPA1的表达降低,凋亡蛋白Bax和caspase-3的升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的降低。Ru360（MCU的抑制剂）会改善线粒体分裂蛋白Drp1向线粒体转移,OPA1水平得到一定程度的恢复,细胞凋亡程度减轻,在体模型的心梗面积缩小、体外模型的心肌损伤指标和细胞活力改善。精胺（MCU的激动剂）的作用与Ru360的效果相反,会使得HR的细胞的线粒体分裂和凋亡加重。线粒体形态的电镜显像和染色显像也显示了MCU促进线粒体分裂和损伤的作用。其次,我们发现I/R时calpain1和calpain2的表达和活性明显升高,Ru360可降低I/R诱导的calpain表达或激活,spermine更使得calpain1和calpain2表达活性进一步增加,细胞实验结果同小鼠体内实验结果一致。说明calpain的表达受MCU调控。第三部分Calpain通过Drp1和OPA1促进线粒体分裂和细胞凋亡在这一部分实验中,我们证明了calpain参与I/R损伤的发生及其可能机制。首先在Tg-CAST的I/R模型,过表达calpainstatin的小鼠心肌损伤区域更小,线粒体损伤程度较轻,这是由于Tg-CAST在I/R时心肌calpain活性较低。I/R时calpain的激活引起Drp1向线粒体移位,以及OPA1水平降低,相应地线粒体分裂增加,细胞凋亡指标上升,这可能是calpain的作用机制。细胞H/R模型中,PD150606的干预提示calpain可能介导Drp1移位和OPA1下调,线粒体荧光染色和流式凋亡显示线粒体动态和细胞凋亡程度,与动物实验结果一致。这些结果表明MCU/calpain可能通过调节Drp1和OPA1影响线粒体动态和细胞凋亡,参与心肌损伤。结论:本研究通过从体内和体外心肌I/R模型,证明I/R时MCU表达显著升高,并通过钙内流引起calpain的高表达和激活,引起线粒体过度分裂和细胞凋亡。其中calpain可能通过促Drp1移位和OPA1降解的途径促进线粒体分裂。总之,MCU/calpain通路激活,引发线粒体过度分裂和凋亡,是I/R损伤的可能机制之一。