【摘 要】
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第一部分 研究发现,乙肝病毒x蛋白HBx和核受体法尼酯X受体FXR(FarnesoidXreceptor,NRlH4)与肝细胞再生和原发性肝癌发生密切相关。然而,FXR或FXR信号通路在HBV感染相关HCC中
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第一部分 研究发现,乙肝病毒x蛋白HBx和核受体法尼酯X受体FXR(FarnesoidXreceptor,NRlH4)与肝细胞再生和原发性肝癌发生密切相关。然而,FXR或FXR信号通路在HBV感染相关HCC中的作用机制不甚明了。我们采用HBx稳定表达和瞬时过表达小鼠模型、荧光素酶报告系统、GST-pulldown、Co-IP、ChIP、EMSA等系列实验,发现HBx通过蛋白—蛋白相互作用影响FXR,进而激活FXR的转录,调控FXR信号通路下游靶基因的表达。进一步发现HBx结合到FXR上的分子模式可能是通过形成FXR/HBx/RXR异源三聚体来实现的。主要表现为HBx羧基端的α螺旋可以与FXR氨基端的AF1结构域结合,而HBx氨基端的α螺旋与RXR的LBD结合。EMSA实验结果提示,HBx调控FXR或FXR信号通路可能是通过HBx促进FXR/RXR结合到FXRE上实现的。为进一步探讨HBx与FXR相互作用的分子机制,我们通过构建HBx缺失突变体发现HBx羧基端的α螺旋在结合和激活FXR或FXR信号通路中发挥重要作用。结合已有的文献报道,我们比较和分析了HCC临床肝癌样品中HBX、FXR及FXR信号传导通路中相关基因的表达谱,发现HBx羧基端截短体普遍存在,且癌和癌旁FXR和FXR信号通路相关基因差异显著。此外,我们的实验结果还发现,HBx羧基端截短体(第三个α螺旋结构缺失)不但会丧失增加FXR/RXR异源二聚体的DNA结合能力,而且激活FXR转录活性的能力也显著下降。基于FXR可能是HCC的保护因素,我们分析了HBx/HBx羧基端截短体、FXR与NF-κB、炎症因子和HCC的关系。初步发现iNOS可能是其中的一个潜在靶点。据此,推测HBx羧基端截短体与FXR的相互作用可能与HCC的发生关系密切。 综上,考虑到全长的HBx作为FXR或FXR信号通路的一个辅因子,可以通过增强FXR/RXR结合到FXRE上,并激活FXR及相关信号通路,发挥抑制炎症的作用;而HBx羧基端截短体通常会丧失有效调节FXR和FXR信号通路的功能。基于HCC病人中HBx羧基端截短体和全长HBx共存的事实,我们认为,HBx羧基端截短体和全长HBx通过对FXR信号通路的不同影响,在HCC的发生发展中具有重要作用。 第二部分 HBx是HBV感染相关HCC发生的重要因素,但其分子作用机制不清。PXR(Pregnane(X)receptor,NR1(I)2)是核受体超家族中亚家族1的一个重要成员,广泛分布于肝、结肠和小肠等组织。其功能主要与体内许多内源性或外源性的化学物质清除、药物间相互作用的关键性调控有关。我们的研究发现HBx以配体依赖的方式增强PXR的转录活性,而且这种转录激活呈剂量依赖关系。我们先后通过Co-IP和GST-pulldown手段分别从invivo和invitro水平证实:HBx和PXR间存在蛋白—蛋白间相互作用。哺乳动物细胞双杂交、GST-pulldown进一步揭示PXR和HBx间相互作用主要定位于PXR的LBD。尽管EMSA实验结果提示,HBx、PXR/XR与PXRE间的蛋白—DNA相互作用不同于HBx和FXR/RXR与FXRE间的作用,但瞬时共表达的HBx和PXR可以显著上调PXR靶基因—药物Ⅰ相代谢酶中的CYP3A4的mRNA水平;HCC组织标本中PXR和PXR相关靶基因在癌和癌旁的差异表达结果等提示我们:HCC中HBx的表达可能与PXR信号通路的异常相关。我们的研究结果提示:HBx和PXR间的相互作用可能是解释HCC中HBV感染因素和化学致癌两大危险因素相互网络中的一个重要节点,或为肝癌解毒及代谢异常在HCC发生发展中的作用、HBV相关HCC的发生机理提供线索。
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