以香叶基香叶基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP）为前体,可以合成多种二萜化合物骨架及其衍生物,如紫杉醇和丹参酮;也可合成类胡萝卜素化合物如β-胡萝卜素、虾青素、藏红花酸等,它们在医药化学品、食品色素和医药化学品等方面具有重大的应用潜力。利用微生物细胞工厂从普通廉价碳源出发合成这些高附加值的二萜类化合物是对目前以植物提取为主的传统生产方式的重要补充,并且具有原料易得、过程可控,具有可持续性等优势。然而,已有的报道中二萜类化合物的异源生物合成产量很多均在毫克/升级别,极大的制约了它的后续产业化开发。其中亟待解决的问题包括:1)长路径多酶间代谢通量不平衡,二萜类化合物前体GGPP供应不充足;2)二萜类化合物合成路径中P450酶的异源表达受限等。为解决以上问题,本文拟开发二萜类化合物前体GGPP高产酿酒酵母菌株平台,并且用于二萜类物质,如紫杉醇前体和藏红花酸的生物合成,为后续其他二萜类化合物的异源合成提供更多指导和参考。针对酿酒酵母GGPP供应不足的问题,以香叶基香叶醇（geranylgeraniol,GGOH）作为GGPP代谢积累的指示物,组合筛选三种不同来源的GGPP合成酶,并且与MVA路径其他关键基因进行组合表达,确定了酿酒酵母中影响GGPP合成的关键酶及其来源。对于筛选出的关键基因,采用长路径多酶间代谢通量平衡策略,将路径模块化组合,利用delta位点整合在底盘菌株BY4742中构建目标菌株库。菌株库中GGOH产量变化动态范围很大,从21.45 mg/L到105.67 mg/L。后续通过比较不同底盘的适配情况,在CENPK2-1D菌株中采取相同的组装策略,获得的GGOH产量变化范围为25.29 mg/L到199.01 mg/L。通过对发酵培养基的优化,以及碳源限制策略下进行5L发酵罐实验,GGOH的产量达到了1315.44 mg/L。同时对于整个组合设计过程中,影响GGOH产出的关键因素进行了解析,揭示嗜热酸硫化叶菌来源GGPP合成酶GGPPSsa的表达量与GGOH的产量呈正相关,证明了GGPP合成酶的催化反应的仍然是GGPP生产的限速步骤。相关路径模块的拷贝数对于GGOH的产出也起到了至关重要的作用。在获得高产GGPP的底盘的基础上,首先通过CRISPR-Cas9方法敲除GGPP水解酶LPP和DPP,减少GGPP水解率达60%,再通过N端穿膜工程,引入紫杉二烯合酶,以及不同长度N端截短的紫杉二烯-5α-羟化酶与不同来源的P450还原酶融合蛋白,成功实现5α羟化紫杉二烯醇在酵母中的从头合成,发现紫杉二烯-5α-羟化酶的N截短不能超过42aa,以保证酶的催化效率;随着路径的延长,GGPP可以用于合成重要天然产物藏红花酸。利用计算机辅助蛋白建模,理性解析了关键蛋白Crt Z和CCD2的不同蛋白融合方式对于产物产出的影响,揭示正向融合中CCD2关键催化风车结构完整,有利于Crt Z的产物玉米黄质更有效的扩散到CsCCD2疏水的底物通道部位,提高风车结构的中心铁离子对玉米黄质进行催化裂解效率,进而提高藏红花酸的积累。通过发酵罐的培养优化,最终获得的藏红花酸产量达到12.43±0.62 mg/L,是迄今微生物异源表达藏红花酸的最高产量。