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茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf.为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,是一种常用中药,始载于《本草经》,味甘淡,性平,有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功能。现代药理研究表明,茯苓具有抗肿瘤、保肝、降脂、增强免疫等作用。近年来,茯苓用于炎症性肠病(IBD)的治疗日益受到人们重视,但其活性成分及作用机理仍不明确。羧甲基茯苓多糖(CMP)是茯苓中的主要活性成分,前期未见羧甲基茯苓多糖用治炎症性肠病的研究。本项目采用体外培养的人结肠上皮Caco-2细胞模拟机体肠道上皮屏障,采用TNF-α诱导Caco-2细胞制备体外肠道屏障功能损伤模型,观察CMP对受损肠道屏障的保护作用,并从紧密连接蛋白表达探讨其作用的分子机制,为CMP用于临床治疗IBD提供实验依据。目的:探讨CMP预防TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞的作用机制,为CMP进一步用于IBD临床治疗提供依据。方法:1.TNF-α对Caco-2细胞增殖的影响:采用MTT法检测不同浓度的TNF-α对Caco-2细胞增殖的影响。2.TNF-α对Caco-2细胞紧密连接结构的影响:检测细胞跨膜电阻值观察不同浓度TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接结构的影响。3.TNF-α对Caco-2细胞紧密连接mRNA表达的影响:利用qPCR技术检测TNF-α对Caco-2细胞紧密连接mRNA的表达的影响。4.TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白表达的影响:利用免疫印迹的方法检测TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白表达的影响。5.CMP对Caco-2细胞增殖的影响:采用MTT法检测不同浓度的CMP对Caco-2细胞增殖的影响。6.CMP对受损肠道上皮屏障紧密连接结构的影响:检测细胞跨膜电阻值观察CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接结构的影响。7.CMP对受损肠道上皮屏障紧密连接功能的影响:检测细胞酚红透过率观察CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接功能的影响。8.CMP对受损肠道上皮细胞紧密连接Occludin mRNA和ZO-3 mRNA的影响:利用qPCR技术检测CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接Occludin mRNA、Z0-3 mRNA的表达影响。9.CMP对受损肠道上皮紧密连接Occludin蛋白和Z0-3蛋白表达的影响:通过Western blot方法检测CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接Occludin蛋白、Z0-3蛋白表达,观察CMP对紧密连接Occludin蛋白、Z0-3蛋白表达的影响。10.CMP对受损肠道上皮紧密连接Occludin蛋白、Z0-3蛋白分布的影响:利用免疫荧光的方法检测CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接Occludin蛋白、Z0-3蛋白分布的影响。11.CMP对核转录因子NF-κ B以及MLCK、p-MLC信号通路的影响:采用Western blot方法检测CMP对TNF-α损伤人结肠上皮Caco-2细胞核转录因子NF-κ B以及MLCK、p-MLC信号通路的影响。结果:1.0ng/ml-150ng/ml的TNF-α对Caco-2细胞的生长没有促进或者抑制作用。2.50ng/ml-150ng/ml的TNF-α降低Caco-2细胞跨膜电阻值。3.50ng/ml-150ng/ml 的 TNF-α 下调紧密连接 Occludin mRNA 和 ZO-3 mRNA 的表达。4.50ng/ml-150ng/ml的TNF-α下调紧密连接Occludin蛋白的表达。5.50 μ g/ml-150 μ g/ml的CMP对Caco-2细胞的生长没有促进或者抑制作用。6.CMP升高TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞跨膜电阻值。7.CMP降低TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞酚红透过率。8.CMP上调TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接Occludin mRNA、Z0-3 mRNA表达。9.CMP上调TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞紧密连接Occludin蛋白、Z0-3蛋白表达。10.CMP使TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞Occludin蛋白、Z0-3蛋白分布变的光滑、平直,并且荧光信号强度增强。11.CMP明显下调TNF-α损伤的人结肠上皮Caco-2细胞NF-κ B、MLCK、p-MLC信号通路蛋白的表达。结论:CMP保护TNF-a损伤的人结肠上皮Caco-2细胞,维持其紧密连接的结构、功能完整性,可能与NF-κB、MLCK、p-MLC信号通路,以及紧密连接Occludin和ZO-3的mRNA,蛋白表达以及分布有关。我们的研究证实CMP具有保护受损肠道屏障的作用,为CMP用于炎症性肠病的临床治疗奠定了基础。